本發(fā)明涉及低鐵補血劑、黑木耳黑色素活性成分及其用途。
背景技術：
：缺鐵性貧血(irondeficiencyanemia，ida)是人體內鐵儲備耗竭導致血紅蛋白合成減少而引起的貧血。這類貧血的特點是骨髓、肝、脾等組織中缺乏可染色鐵，血清鐵、轉鐵蛋白飽和度和鐵蛋白降低。導致缺鐵性貧血的發(fā)病原因較多，一般歸納為：(1)鐵需要增加，多發(fā)生于嬰幼兒和妊娠期婦女；(2)鐵攝入不足及吸收不良，造成鐵攝入不足的常見原因是食物中鐵的含量不足、偏食，食物中蔬菜、谷類、茶葉中的磷酸鹽、植酸、單寧酸均會減少鐵在胃腸道的吸收；(3)慢性出血，導致慢性失血的原因很多，男性患者一般為胃腸道的急性和慢性出血，女性患者的患病原因多為月經(jīng)過多。缺鐵性貧血最終結果均是由于體內的鐵不足以維系機體代謝對鐵的需求，影響血細胞內血紅素的合成從而導致缺鐵性貧血的發(fā)生。作為全世界發(fā)病率居高不下的營養(yǎng)缺乏類型疾病之一，缺鐵性貧血不同程度的影響著全世界約22億人口，該病在發(fā)展中國家的發(fā)病率明顯高于發(fā)達國家，在我國各階層及年齡段人群中缺鐵性貧血發(fā)病率約為20％，情況嚴重地區(qū)兒童缺鐵性貧血的發(fā)病率高達70％。根據(jù)調查顯示：在6個月～2歲嬰幼兒中鐵缺乏癥的年發(fā)病率為75.0％～82.5％、妊娠3個月以上婦女患有鐵缺乏癥的比例為66.7％、育齡婦女此比例為43.3％，10歲～17歲青少年此比例為13.2％；以上人群中缺鐵性貧血(ida)患病率分別是33.8％～45.7％，19.3％，11.4％，9.8％。當缺鐵性貧血發(fā)生時，機體最開始的改變是多個組織或器官缺鐵，表現(xiàn)為鐵缺乏癥，組織中與鐵相關的酶活性和酶活力顯著下降，患有缺鐵性貧血的人表現(xiàn)出體力、免疫力、肌肉耐力等下降，由于血紅蛋白和紅細胞數(shù)量的減少，血液的運氧能力下降，這可導致組織缺氧，患者出現(xiàn)神疲乏力、精神狀態(tài)下降、胸悶氣短、頭暈目眩等癥狀。世界上大多數(shù)人口的飲食中是缺乏鐵元素，尤其是在以植物性食物為主的國家。在預防和治療缺鐵性貧血過程中，口服鐵劑顯然是最為理想的，使用鐵補充劑或營養(yǎng)強化劑是目前用于治療或防治缺鐵性貧血的主要方法，由于其簡單方便易于臨床應用，膳食補鐵和口服補鐵藥物來預防和治療缺鐵性貧血被廣泛應用。截至目前，世界衛(wèi)生組織允許使用的用于治療缺鐵性貧血的補血劑大概有30余種，這些鐵補充劑按照鐵的存在狀態(tài)主要分為無機鐵和有機鐵兩大類，按照其在人體中的存形式分為血紅素鐵和非血紅素鐵兩大類。然而，雖然這些補鐵劑經(jīng)過了長期的應用和發(fā)展，但仍存在一些不足和其他副作用。亞鐵鹽類化合物是補鐵效果最好的補鐵劑，但可以引起多種副作用。研究發(fā)現(xiàn)口服補鐵劑可能會使結腸中產生的自由基增加導致粘膜細胞損傷，還可以增加大鼠結腸中的脂質過氧化，從而影響腸上皮細胞完整性；另有研究發(fā)現(xiàn)，鐵缺乏和鐵超載都與免疫應答受損有關，原因在于服用補鐵劑后會有大量不能被人體吸收的鐵進入腸道所導致。長期服用補鐵劑的副作用包括上腹疼痛、惡心、腹瀉、便秘，以至于患者不得不停止治療。為了能夠治療缺鐵性貧血，患者在忍受高劑量水平鐵劑補充帶來痛苦的同時，大量未被吸收的鐵會隨著食物和胃腸的蠕動到達大腸而被腸道菌群利用，打破腸道菌群的平衡，對腸道健康造成不利的影響。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有補鐵劑會引起惡心、腹痛、腹瀉、便秘，腸道菌群失調、對胃腸健康造成危害等副作用，在保持至少相等補血效果的同時大量降低藥劑中的鐵含量，避免鐵超載影響人體免疫應答，而提供的低鐵補血劑、黑木耳黑色素活性成分f1及其用途。黑木耳黑色素活性成分f1按以下步驟制備獲得：一、將黑木耳黑色素以5mg/ml的濃度溶于naoh溶液中，然后上樣葡聚糖凝膠sephadexg-200柱；二、用濃度為50mmol/l、ph為7.5的pbs緩沖液進行洗脫，流速為1.2ml/min，收集第34～50min洗脫液，并調節(jié)ph值至2，然后靜置、再4000r/min離心15min后用蒸餾水洗滌沉淀，之后真空冷凍干燥，即得到黑木耳黑色素活性成分f1；其中，步驟一中naoh溶液的濃度為0.2mol/l。本發(fā)明中黑木耳黑色素的制備方法：黑木耳經(jīng)烘干后粉碎，過60目篩。準確稱取黑木耳粉末樣品10g，加入250ml濃度為3mol/l的鹽酸，70℃下攪拌浸提1h，混合物經(jīng)4000r/min離心15min，分離上清和沉淀，收集沉淀用氫氧化鈉調節(jié)ph值至12，充分溶解攪拌后，再經(jīng)4000r/min離心15min，取上清，上清液用濃度為3mol/l的鹽酸調節(jié)ph至2，靜置，4000r/min離心15min后得到黑色素粗品，黑色素粗品用濃度為7mol/l的hcl在100℃下水解2h，10000r/min離心20min，沉淀依次用氯仿、乙酸乙酯和乙醇洗滌，之后沉淀再用蒸餾水洗滌3～5次，再一次離心，取沉淀，經(jīng)冷凍干燥即得黑色固體粉末狀的黑木耳黑色素。本發(fā)明黑木耳黑色素活性成分f1的紅外掃描圖譜如圖1所示，其結構特點與復雜的生物大分子的結構特點十分相似，黑木耳黑色素活性成分f1具有多種官能團才得以使其紅外光譜掃描圖中具有多個寬而強的吸收峰。在黑木耳黑色素活性成分f1的紅外光譜掃描圖譜中，在3200cm-1附近出現(xiàn)的寬峰，是由oh和nh2基團伸縮振動引起的；在2950～2850cm-1處的吸收峰說明有脂肪族c-h的存在；1650～1500cm-1處的強烈吸收，與芳香族c＝c和coo的振動有關；1400～1200cm-1位置的吸收峰顯示酚類coh和吲哚以及nh的存在；800～600cm-1范圍的相對小的吸收峰代表著芳香環(huán)的存在。在黑木耳黑色素活性成分f1的1hnmr光譜中，0.8～1.0ppm范圍為脂肪族區(qū)，出現(xiàn)的信號認定為烷基片段的ch3基團，例如ch2ch3，ch(ch3)2，可能來自殘留的蛋白質；在2.0ppm附近的信號是屬于亞甲基或酯基(-ococh3)，表明羧酸結構的存在；在4ppm周圍的峰被認定為結合于吲哚或吡咯環(huán)的甲基(n-ch3)和結合到環(huán)上的第一個位置的-och3；6.5和7.3ppm的信號是吲哚或吡咯環(huán)的芳香族氫原子；8.5ppm附近的信號是吲哚或吡咯環(huán)上的羧基質子。其中，位置在5ppm出現(xiàn)的強信號是溶劑中naoh中h的峰。黑木耳黑色素的1hnmr光譜中，2.0ppm附近的信號強于黑木耳黑色素活性成分f1，說明黑木耳黑色素的羧酸結構比例更高；4ppm周圍的峰面積小于黑木耳黑色素活性成分f1，代表吲哚或吡咯環(huán)的比例較小。表明黑木耳黑色素含有更多的蛋白質，而黑木耳黑色素活性成分f1含有更多的用來構成骨架的吲哚或吡咯環(huán)。將黑木耳黑色素活性成分f1和黑木耳黑色素噴涂au后用環(huán)境掃描電子顯微鏡直接成像，觀察黑木耳黑色素活性成分f1和黑木耳黑色素的微觀結構。黑木耳黑色素是由表面不規(guī)則的球形單體組成，并且呈層層堆疊結構，通過軟件測量黑木耳黑色素單體平均粒徑約為1μm(如圖4所示)。大量黑木耳黑色素單體聚合如圖5所示，呈較大體積的不規(guī)則塊狀形態(tài)，表面的氣孔表示黑木耳黑色素的結合并不緊密。本發(fā)明黑木耳黑色素活性成分f1有更明顯的片層結構，且表面比黑木耳黑色素光滑，單體間結合的更加緊密(如圖6所示)。黑木耳黑色素活性成分f1大量聚合如圖7所示，形成較大體積的不規(guī)則塊狀形態(tài)，但表面比黑木耳黑色素更光滑致密，說明單純黑木耳黑色素活性成分f1比黑木耳黑色素結合的更加緊密，單體與單體之間的連接更加堅固。本發(fā)明黑木耳黑色素活性成分f1在光照條件下和室溫條件下具有比黑木耳黑色素更為優(yōu)異的穩(wěn)定性。本發(fā)明黑木耳黑色素活性成分f1可以明顯提高ida小鼠模型的血紅蛋白和血紅細胞數(shù)，改善造血因子，增加鐵吸收，有效改善缺鐵性貧血。由于黑木耳黑色素活性成分f1中并不含大量的鐵元素，因此不會在結腸中產生自由基損傷粘膜細胞，不會增加結腸中的脂質過氧化，影響腸上皮細胞的完整性。而且不會損害人體免疫應答系統(tǒng)，不會引起惡心、腹痛、腹瀉、便秘等不良癥狀。本發(fā)明黑木耳黑色素活性成分f1能夠改善缺鐵性貧血人群腸道菌群結構、增加豐度。低鐵補血劑主要由木耳黑色素活性成分f1組成。其中，低鐵補血劑中還包括黑木耳黑色素。黑木耳黑色素活性成分f1作為低鐵補血劑的應用。黑木耳黑色素作為低鐵補血劑的應用。黑木耳黑色素活性成分f1作為缺鐵性貧血患者腸道菌群調節(jié)劑的應用。黑木耳黑色素作為缺鐵性貧血患者腸道菌群調節(jié)劑的應用。黑木耳黑色素活性成分f1可以有效提高缺鐵性貧血小鼠紅細胞數(shù)量及血紅蛋白的濃度，灌胃口服黑木耳黑色素活性成分f1和黑木耳黑色素的缺鐵性貧血小鼠紅細胞的數(shù)量和血紅蛋白濃度均顯著高于ida組，并恢復到正常水平。黑木耳黑色素活性成分f1對缺鐵性貧血的恢復作用并不受飲食成分的干擾。附圖說明圖1是本發(fā)明黑木耳黑色素活性成分f1的紅外掃描圖譜。圖2是本發(fā)明黑木耳黑色素活性成分f1的1hnmr掃描圖譜。圖3是黑木耳黑色素的1hnmr掃描圖譜。圖4是黑木耳黑色素的掃描電鏡圖。圖5是大量單體聚合黑木耳黑色素的掃描電鏡圖。圖6是黑木耳黑色素活性成分f1的掃描電鏡圖。圖7是大量單體聚合黑木耳黑色素活性成分f1的掃描電鏡圖。圖8是實驗2中根據(jù)各組小鼠糞便總dna，得到的小鼠腸道菌群細菌群落組成分析圖譜。圖9是實驗3中黑木耳黑色素活性成分f1和黑木耳黑色素自然光照射條件下保存率檢測結果圖。圖10是實驗3中黑木耳黑色素活性成分f1和黑木耳黑色素室溫條件下保存率檢測結果圖。具體實施方式本發(fā)明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式，還包括各具體實施方式間的任意組合。具體實施方式一：本實施方式黑木耳黑色素活性成分f1按以下步驟制備獲得：一、將黑木耳黑色素以5mg/ml的濃度溶于naoh溶液中，然后上樣葡聚糖凝膠sephadexg-200柱；二、用濃度為50mmol/l、ph為7.5的pbs緩沖液進行洗脫，流速為1.2ml/min，收集第34～50min洗脫液，并調節(jié)ph值至2，然后靜置、再4000r/min離心15min后用蒸餾水洗滌沉淀，之后真空冷凍干燥，即得到黑木耳黑色素活性成分f1；其中，步驟一中naoh溶液的濃度為0.2mol/l。黑木耳黑色素及黑木耳黑色素活性成分f1的元素含量如表1所示，黑木耳黑色素的n、c、h、s四種元素的含量均高于黑木耳黑色素活性成分f1。其中，黑木耳黑色素的n含量為10.38％高于黑木耳黑色素活性成分f1的n含量，說明黑木耳黑色素可能含有更多的蛋白質，這與傅里葉紅外掃描圖的結果相互印證。表1注：表中o％＝100％-n％-c％-h％-s％本實施方式所使用的黑木耳為東寧黑木耳產業(yè)基地提供，菌種編號：hdxz-1。鐵調素(hepcidin)作為鐵代謝調節(jié)中最關鍵的調節(jié)分子(如胰島素調節(jié)血糖一樣)，調節(jié)人體對鐵的代謝吸收能力，鐵調素的活性與人體鐵吸收能力呈負相關性。分析認為黑木耳黑色素活性成分f1可作用于鐵調素，提高鐵的吸收和利用。低溫有利于黑木耳黑色素活性成分f1的保存，長時間加熱會降低黑木耳黑色素活性成分f1保存率；ph值會顯著的影響黑木耳黑色素活性成分f1的溶解性，堿性條件更有利于黑木耳黑色素活性成分f1的溶解；k+、ca2+和mg2+會顯著降低黑木耳黑色素活性成分f1的吸光值，cu2+和fe3+會使黑木耳黑色素活性成分f1的吸光值升高；黑木耳黑色素活性成分f1容易被氧化劑氧化，但還原劑對其穩(wěn)定性沒有顯著影響；苯甲酸鈉、山梨酸鉀、谷氨酸鈉和丁基化羥基茴香醚這四種食品添加劑對黑木耳黑色素活性成分f1穩(wěn)定性影響不大。黑木耳黑色素活性成分f1以吡咯環(huán)和吲哚環(huán)為骨架，骨架上連接著脂肪碳鏈和羰基，這些結構大量聚合后形成不規(guī)則的單體，單體以層疊的形式聚合，組成表面較光滑的不規(guī)則黑木耳黑色素活性成分f1。在207nm處有強吸收峰，通過對黑木耳黑色素活性成分f1中s元素的含量計算可知，黑木耳黑色素活性成分f1中真黑色素與棕黑色素的含量比為10.36:1。具體實施方式二：本實施方式與具體實施方式一的不同點是：步驟二中葡聚糖凝膠sephadexg-200均先用濃度為50mmol/l、ph為7.5的pbs緩沖液沖洗穩(wěn)定后再上樣。其它步驟及參數(shù)與實施方式一相同。具體實施方式三：本實施方式與具體實施方式一或二的不同點步驟二中葡聚糖凝膠sephadexg-200直徑為1.6cm、長度為64cm。其它步驟及參數(shù)與實施方式一或二相同。具體實施方式四：本實施方式低鐵補血劑主要由木耳黑色素活性成分f1組成。本實施方式低鐵補血劑中還可以包括黑木耳黑色素；黑木耳黑色素與黑木耳黑色素活性成分f1的質量比為1～100:1。具體實施方式五：本實施方式黑木耳黑色素活性成分f1作為低鐵補血劑的應用。具體實施方式六：本實施方式黑木耳黑色素作為低鐵補血劑的應用。具體實施方式七：本實施方式黑木耳黑色素活性成分f1作為缺鐵性貧血患者腸道菌群調節(jié)劑的應用。具體實施方式八：本實施方式黑木耳黑色素作為缺鐵性貧血患者腸道菌群調節(jié)劑的應用。實驗1：1.1缺鐵性貧血小鼠模型造模方法參照《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范實施手冊》中的方法，試驗采用體重14.0±1.7g昆明種24日齡雄性小鼠，小鼠在實驗室適應3～5天后，隨機選取130只小鼠開始喂飼低鐵飼料，飲用去離子水，采用非鐵制籠蓋和塑料籠體，嚴格避免鐵的污染。兩周后隨機選10只小鼠從尾部采血，采用血細胞自動分析儀測定小鼠的血紅蛋白含量，若飼低鐵飼料試驗小鼠平均血紅蛋白(hb)≤100g/l為造模成功。1.2小鼠飼養(yǎng)和分組小鼠飼養(yǎng)于黑龍江大學生命科學學院動物培養(yǎng)室。實驗室設施條件及動物日常管理工作依照《中華人民共和國衛(wèi)生部實驗動物環(huán)境及設施標準》實施，環(huán)境溫度為20±2℃，環(huán)境相對濕度為45％～65％，自動控制12h晝夜更替。造模成功后，隨機分成4組，每組30只，分別為缺鐵性貧血組(ida)，缺鐵性貧血+黑木耳黑色素組(ida+m)，缺鐵性貧血+黑木耳黑色素活性成分f1組(ida+f1)，缺鐵性貧血+硫酸亞鐵組(ida+fe2+)；另外取30只29日齡正常健康雄性小鼠作為正常對照組(control)。control組和ida組灌胃蒸餾水，ida+m組灌胃黑色素、給藥劑量為200mg/kg·d，ida+f1組灌胃黑色素f1、給藥劑量為179.51mg/kg·d，ida+fe2+組灌胃硫酸亞鐵組、給藥劑量為5mg/kg·d，連續(xù)灌胃。正常組始終飼喂正常飼料，各缺鐵性貧血組始終飼喂低鐵飼料。自試驗開始，所有組小鼠每7d測量一次體重，并做好記錄。停止灌胃當天，取小鼠眼球血，用于外周血常規(guī)分析、血清促紅細胞生成素(epo)、干細胞因子(scf)、血清特異轉錄因子gata-1、血清鐵(si)含量的測定。實驗觀察：造模過程中小鼠開始出現(xiàn)掉毛，皮毛稀疏，腳爪和尾部皮膚蒼白，活動減少，萎蔫，畏寒怕冷等現(xiàn)象，隨著試驗的延長，以上現(xiàn)象越發(fā)明顯，并且生長緩慢，皮毛失去光澤。血常規(guī)指標可見，造模結束后小鼠血紅蛋白(hb)含量、紅細胞數(shù)(rbc)、紅細胞壓積(hct)、血小板數(shù)(plt)與control組相比分別下降了47.5％、36.89％、37.58％、64.46％，具有統(tǒng)計學上的極顯著差異(p<0.01)，平均紅細胞體積(mcv)與control組相比下降了16.15％，有顯著性差異(p<0.05)。ida組小鼠平均血紅蛋白含量(hb)≤100g/l，紅細胞數(shù)(rbc)≤7.7×1012/l，紅細胞壓積(hct)≤36％，平均紅細胞體積(mcv)≤48μm3，血小板數(shù)(plt)≤157×106/l。表明飼喂低鐵飼料的小鼠出現(xiàn)了明顯的貧血現(xiàn)象，說明造模成功。表2造模結束時小鼠外周血象hb(g/l)rbc(1012/l)hct(％)mcv(μm3)plt(106/l)正常對照組166.67±15.2810.93±0.7451.67±4.7351.13±2.06192.67±29.56模型組87.50±12.58**6.90±0.63**32.25±3.59**42.88±2.90*68.50±24.84**參考值100～1907.7～12.536～5048～51157～260正常組始終飼喂正常飼料，各缺鐵性貧血組始終飼喂低鐵飼料。實驗前2周小鼠均灌胃蒸餾水，小鼠處于快速生長期，各缺鐵性貧血組與正常飼料組體重穩(wěn)步增長，各組間沒有差異(p<0.05)。從第3周開始給予相應的灌胃(ida+m組灌胃黑色素、給藥劑量為200mg/kg·d，ida+f1組灌胃黑色素f1、給藥劑量為179.51mg/kg·d，ida+fe2+組灌胃硫酸亞鐵、給藥劑量為5mg/kg·d)各組小鼠的體重都隨著時間的延長而穩(wěn)步增加，但是增加的速度各不相同，control組體重增長最快，ida+m組次之，ida+f1組小鼠增長速度略低于ida+m組，ida+fe2+組體重增長速度低于ida+f1組，ida組的體重低于其余各組，為各組最低。各組小鼠血液常規(guī)如表3所示。給予藥物灌胃干預3周后，ida+f1組小鼠紅細胞數(shù)、血紅蛋白量、紅細胞壓積、平均紅細胞體積、平均血紅蛋白量、平均血紅蛋白濃度、血小板相對于ida組平均升高了43.56％、94.34％、60％、6.31％、14.33％、5.42％、21.81％(p<0.05)，同時與control組無顯著差異(p>0.05)，已達到正常水平；黑木耳黑色素活性成分f1可以有效改善小鼠缺鐵性貧血。黑木耳黑色素活性成分f1可以有效提高缺鐵性貧血小鼠紅細胞數(shù)量及血紅蛋白的濃度，灌胃黑木耳黑色素活性成分f1和黑木耳黑色素的缺鐵性貧血小鼠紅細胞的數(shù)量和血紅蛋白濃度均顯著高于ida組，并恢復到control組水平。而ida組小鼠血紅蛋白，紅細胞數(shù)仍然保持較低的水平，處于貧血狀態(tài)，說明試驗期間持續(xù)的飼喂低鐵飼料，保證了小鼠不會因飲食恢復正常而使得貧血的得到恢，從側面驗證了黑木耳黑色素活性成分f1對缺鐵性貧血的作用非因飲食改變而使得貧血得到恢復。小鼠血液常規(guī)檢測數(shù)據(jù)反映出黑木耳黑色素活性成分f1和黑木耳黑色素具有提高紅細胞壓積、紅細胞體積、平均血紅蛋白量和平均血紅蛋白濃度的作用。表3controlidaida+fe2+ida+mida+f1wbc(109/l)6.42±0.90a1.82±0.50c3.28±1.06b6.45±1.20a6.80±0.86arbc(1012/l)10.10±0.82b7.15±0.74c10.88±0.92ab11.38±1.37a10.22±1.31bhb(g/l)155.00±15.17bc85.00±15.17d156.67±8.16bc171.67±7.53ab171.67±11.69abhct(％)51.67±6.22a38.83±4.75b51.17±4.36a54.50±8.02a52.00±6.72amcv(fl)51.08±2.69a47.58±2.81b47.05±2.52b52.63±1.55a50.30±3.10amch(pg)15.37±0.54ab13.88±1.33c14.43±0.58bc15.90±0.47a15.15±1.67abmchc(g/l)300.67±8.82cd291.33±12.31d307.17±18.03c340.67±9.56a314.50±14.27bplt(109/l)818.33±262.94ab653.33±269.79b1058.33±132.27a885.00±227.93ab806.17±109.43b試驗期間持續(xù)飼喂低鐵飼料，排除了小鼠貧血癥狀恢復受飲食成分干擾的因素。實驗時間3周，ida+fe2+組小鼠平均紅細胞體積相對于control組出現(xiàn)了顯著下降，血清干細胞因子下降3.86％，血清促紅細胞生成素的濃度顯著下降11.05％，血清特異轉綠因子gata-1的濃度則顯著的降低20.26％，這都顯示硫酸亞鐵在治療缺鐵性貧血時，除了引起腸胃不適癥狀外，很可能會對機體造血功能造成損害，存在較大的潛在危險；而ida+m組和ida+f1組小鼠均未出現(xiàn)上述癥狀。實驗時間3周，雖然ida+fe2+組小鼠白細胞數(shù)比ida組有比較大的回升，但是仍然明顯低于control組、ida+m組和ida+f1，實驗是時間延長至2個月，ida+fe2+組小鼠白細胞數(shù)仍維持在(3.46±1.21)×109/l沒有改善；而且ida+fe2+組小鼠還出現(xiàn)腹瀉、便秘，情緒煩躁等情況，而ida+m組和ida+f1組小鼠均未出現(xiàn)類似癥狀。各組小鼠的造血功能因子數(shù)據(jù)如表4所示。表4controlidaida+fe2+ida+mida+f1scf751.90±50.92bc827.31±64.84b610.48±98.13d904.01±53.30a889.91±52.19aepa136.57±13.64c137.62±11.62c154.65±11.38b182.28±17.70a181.70±14.66agata-111.35±2.12ab10.72±1.02c10.66±1.62c13.00±0.42a13.08±1.53asi1.24±0.06b0.75±0.04d1.20±0.14c1.44±0.06a1.41±0.14a干細胞因子scf是重要的造血細胞因子，血清scf低下可作為引起造血功能障礙的原因，并且scf對于造血干細胞和早期祖細胞粘附骨髓造血微環(huán)境起著關鍵作用。與ida組相比，ida+m組和ida+f1組血清干細胞因子的濃度分別顯著升高了12.89％和10.21％(p<0.05)，而ida+fe2+組血清干細胞因子的濃度并沒有顯著差異(p>0.05)。并且相比于control組，ida+m組和ida+f1組血清干細胞因子濃度顯著升高了19.20％和16.37％(p<0.05)，而ida組的血清干細胞因子濃度略有升高，但并不顯著(p>0.05)。由此可見，當機體發(fā)生缺鐵性貧血時，機體自身的應激反應會使得機體的血清干細胞因子濃度升高，但這一升高并不顯著，在缺鐵性貧血發(fā)生時灌胃黑木耳黑色素和黑木耳黑色素活性成分f1可以顯著提高血清干細胞因子濃度，這表明黑木耳黑色素活性成分f1和黑木耳黑色素有較好的促進血清干細胞因子產生的功能。促紅細胞生成素(epo)是一種主要有腎臟產生的糖蛋白激素，是參與紅系造血的主要調控因子，具有促進紅系祖細胞增殖、分化，維持紅細胞、血紅蛋白穩(wěn)定的作用。與ida組相比，ida+m組和ida+f1組小鼠血清促紅細胞生成素濃度顯著提高28.48％和26.25％(p<0.05)，然而，ida+fe2+組小鼠血清促紅細胞生成素的濃度與ida組沒有顯著差異(p>0.05)；當缺鐵性貧血發(fā)生時，小鼠血清促紅細胞生成素濃度并沒有降低，但control組沒有顯著差異(p>0.05)。由此可見，當缺鐵性貧血發(fā)生時，給予黑木耳黑色素活性成分f1和黑木耳黑色素會提高血清促紅細胞生成素的濃度。血清鐵(si)是指在血液中與轉鐵蛋白結合了的鐵，是和轉鐵蛋白結合形成的復合物，血清鐵用于鑒別缺鐵性以及非缺鐵性的貧血。而轉鐵蛋白對鐵的結合和轉運能力受到調節(jié)因子鐵調素的調控，并與其呈負相關關系。ida+f1組與control組和ida+m組血清鐵濃度無顯著差異(p>0.05)，均維持在正常水平；與ida組小鼠相比，ida+m組和ida+f1組小鼠的血清鐵濃度有顯著提高(p<0.05)，分別提高了87.53％和84.68％；而ida+fe2+組小鼠的血清鐵濃度并沒有得到恢復，與ida組無顯著差異(p>0.05)。由此可見，對于ida組小鼠而言，補充黑木耳黑色素活性成分f1和黑木耳黑色素可以使得血清鐵濃度得到恢復。綜上，黑木耳黑色素活性成分f1和黑木耳黑色素可以改善貧血狀況，由于現(xiàn)有補鐵、補血藥劑都是在其中加入大量鐵源，通過大量的鐵元素補充來改善人體缺鐵、貧血的癥狀。一旦停藥，缺鐵性貧血很容易復發(fā)，而持續(xù)倉時間服用對人體造血機能反而造成不良影響。本發(fā)明不是利用增加鐵源單純性的補鐵，黑木耳黑色素活性成分f1和黑木耳黑色素能夠激活和提高體內的血清干細胞因子濃度，所以用藥后會持續(xù)、長時間產生補鐵、補血效果，具有作用時間長、缺鐵性貧血不易復發(fā)，長時間服用安全有效的優(yōu)點。實驗2：2.1缺鐵性貧血小鼠模型造模方法參照《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范實施手冊》中的方法，試驗采用體重14.0±1.7g昆明種24日齡雄性小鼠，小鼠在實驗室適應3～5天后，隨機選取70只小鼠開始喂飼低鐵飼料，飲用去離子水，采用非鐵制籠蓋和塑料籠體，嚴格避免鐵的污染。兩周后隨機選10只小鼠從尾部采血，采用血細胞自動分析儀測定小鼠的血紅蛋白含量，若飼低鐵飼料試驗小鼠平均血紅蛋白(hb)≤100g/l為造模成功。2.2小鼠飼養(yǎng)和分組小鼠飼養(yǎng)于黑龍江大學生命科學學院動物培養(yǎng)室。實驗室設施條件及動物日常管理工作依照《中華人民共和國衛(wèi)生部實驗動物環(huán)境及設施標準》實施，環(huán)境溫度為20±2℃，環(huán)境相對濕度為45％～65％，自動控制12h晝夜更替。造模成功后，隨機分成3組，每組20只，分別為缺鐵性貧血組(ida)，缺鐵性貧血+黑木耳黑色素活性成分f1組(ida+f1)，缺鐵性貧血+硫酸亞鐵組(ida+s)；另外取20只29日齡正常健康雄性小鼠作為正常對照組(control)。實驗4周，正常組始終飼喂正常飼料，各缺鐵性貧血組始終飼喂低鐵飼料。control組和ida組小鼠灌胃蒸餾水，ida+f1組灌胃黑色素f1、給藥劑量為179.51mg/kg·d，ida+s組灌胃硫酸亞鐵組、給藥劑量為5mg/kg·d。2.3提取各組小鼠糞便總dna實驗觀察：根據(jù)各組小鼠糞便總dna，分析獲得各組小鼠腸道菌群細菌群落組成分如圖8所示。s24-7_norank種屬細菌在正常組、正常+硫酸亞鐵組、正常+黑木耳黑色素組和缺鐵性貧血+黑木耳黑色素組小鼠腸道內是豐度最高的菌群，豐度值分別是23.48％、46.73％、24.85％和24.77％；但是，在缺鐵性貧血組和缺鐵性貧血+硫酸亞鐵組小鼠腸道內，豐度最高的細菌是allobaculum種屬細菌，豐度值分別為30.74％和29.65％。豐度第二的菌群在正常組為alistipes，豐度為10.73％；在正常+硫酸亞鐵組和正常+黑木耳黑色素組分別為ruminococcaceae_uncultured和ruminococcaceae_unclassified，豐度分別為7.81％和11.36％；在缺鐵性貧血組和缺鐵性貧血+硫酸亞鐵組為s24-7_norank，豐度分別為20.90％和17.21％；在缺鐵性貧血+黑木耳黑色素組為bacteroides，豐度為15.99％；豐度第三的菌群在正常+硫酸亞鐵組和缺鐵性貧血+硫酸亞鐵組為alistipes，豐度分別為6.90％和14.27％；在正常對照組為prevotellaceae_uncultured，豐度為9.51％，在正常+木耳黑色素組為blautia，豐度為9.09％；在缺鐵性貧血組為bacteroides，豐度為9.60％；在缺鐵性貧血組為allobaculum，豐度為9.53％。黑木耳黑色素活性成分f1可以扭轉缺鐵性貧血小鼠腸道內豐度出現(xiàn)的下降，s24-7_norank,alistipes,ruminococcaceae_uncultured,blautia,ruminococcaceae(瘤胃菌科)_unclassified,prevotellaceae_uncultured(普雷沃菌屬)等6個主要種屬細菌的豐度。黑木耳黑色素活性成分f1可以降低缺鐵性貧血小鼠腸道內豐度升高的支原體科allobaculum和紫單胞菌科parabacteroides豐度。說明發(fā)生缺鐵性貧血時，小鼠腸道內占主要地位菌群的豐度發(fā)生顯著改變，黑木耳黑色素活性成分f1可以對主要菌群的豐度變化起到調節(jié)作用，使其得到恢復；而硫酸亞鐵則無法達到上述效果。黑木耳黑色素活性成分f1相對于硫酸亞鐵，不會對正常小鼠腸道菌群的種屬分類水平的豐度產生顯著差異性影響，而會對缺鐵性貧血小鼠腸道菌群的豐度產生顯著差異性影響。小鼠腸道菌群整體差異性分析發(fā)現(xiàn)黑木耳黑色素活性成分f1可以縮小缺鐵性貧血小鼠腸道菌群與正小鼠的差異，而硫酸亞鐵無此作用。小鼠腸道菌群微生物多樣性指數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，在缺鐵性貧血發(fā)生時，小鼠腸道菌群的豐度、均勻度及多樣性指數(shù)都會降低，給予缺鐵性貧血小鼠和正常組小鼠黑木耳黑色素活性成分f1，其腸道菌群的豐度、均勻度和多樣性均會增加；給與缺鐵性貧血小鼠硫酸亞鐵，腸道菌群的豐度、均勻度和多樣性指數(shù)僅有略微上升。小鼠腸道代謝物分析：發(fā)生缺鐵性貧血時，小鼠腸道內丙酸、丁酸、乳酸含量顯著降低，并低于正常對照組，乙酸的含量無顯著變化。黑木耳黑色素活性成分f1可以顯著提高缺鐵性貧血小鼠腸道內丙酸、丁酸、乳酸的含量，硫酸亞鐵除可以顯著提高小鼠腸道內乳酸的含量，但反而會使得小鼠腸道內丙酸、丁酸含量顯著低于缺鐵性貧血組。實驗證明黑木耳黑色素活性成分f1提高缺鐵性貧血小鼠腸道菌群豐度、均勻度和多樣性指數(shù)，縮小缺鐵性貧血小鼠與正常小鼠腸道菌群的差異，具有一定的調節(jié)腸道菌群的作用。黑木耳黑色素活性成分f1可以顯著提高缺鐵性貧血小鼠腸道內丙酸、丁酸、軟脂酸、硬脂酸、油酸、氨基酸等代謝物的濃度，并能從總體上縮小貧血小鼠與正常小鼠腸道代謝物的差異，使其腸道代謝物的異常變化得到恢復，并逐漸趨于正常。實驗3：黑木耳黑色素活性成分f1和黑木耳黑色素的性能對比試驗：3.1光照自然光照射4w(保存率測定結果如圖9所示)，黑木耳黑色素活性成分f1及黑木耳黑色素的保存率均呈現(xiàn)下降趨勢，且與初始值相比差異顯著(p<0.05)。說明光照對黑木耳黑色素的破壞作用隨時間延長而增加，可能是由于光照使黑木耳黑色素各組分的結構發(fā)生了不同程度的變化，從而使得其保存率有不同程度的下降。所以黑木耳黑色素對光照敏感，需避光保存。對比發(fā)現(xiàn)黑木耳黑色素活性成分f1較黑木耳黑色素在光照條件下的穩(wěn)定性更好，二者在第3w和第4w的保存率呈現(xiàn)顯著性差異(p>0.05)。黑木耳黑色素活性成分f1對光照射的穩(wěn)定性優(yōu)于黑木耳黑色素。3.2室溫將黑木耳黑色素活性成分f1及黑木耳黑色素置于溫度為25℃環(huán)境中，黑木耳黑色素活性成分f1的保存率隨著時間的延長沒有顯著差異(p>0.05)，而黑木耳黑色素在各時間段間保存率下降顯著(p<0.05)，測定結果如圖10所示。說明黑木耳黑色素活性成分f1在室溫條件下具有比黑木耳黑色素更為優(yōu)異的室溫耐保存性。當前第1頁12

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