本項(xiàng)目源于國(guó)家自然科學(xué)基金，題名：基于可視化質(zhì)譜平臺(tái)的直腸癌早期診斷研究（91959201），起止時(shí)間2019.1-2023.12。研究工作簡(jiǎn)要總結(jié)如下：

主要研究?jī)?nèi)容

本項(xiàng)目以內(nèi)部萃取電噴霧電離質(zhì)譜 （iEESI-MS）技術(shù)為基礎(chǔ)，針對(duì)結(jié)直腸癌早期診斷這一重要科學(xué)問(wèn)題，設(shè)計(jì)適用于直腸癌代謝樣品的高效取樣器和離子源，并采用質(zhì)譜多維數(shù)據(jù)分析方法，開(kāi)發(fā)了一種高特異性、高靈敏度、高通量的分子可視化檢測(cè)技術(shù)，建立了組織、血液、基因和免疫多維一體的數(shù)據(jù)分析方法，并進(jìn)行了免疫治療和可視化診療的拓展研究。

研究方法及研究結(jié)果

（一）直接組織取樣分析

搭建了iEESI-MS分子診察平臺(tái)，快速獲得了173例臨床樣本結(jié)直腸癌組織的化學(xué)特征指紋譜圖，結(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí)算法深入分析了與結(jié)直腸癌進(jìn)展相關(guān)的代謝差異特征和代謝途徑，在分子層面上建立了能夠區(qū)分早期、晚期和正常組織的診斷模型，早期診斷模型準(zhǔn)確率可達(dá)92.6%。找到了對(duì)結(jié)直腸癌演進(jìn)進(jìn)程預(yù)判和可視化診療具有重要意義的功能代謝分子（例如LPC（18:0）），發(fā)現(xiàn)了其與結(jié)直腸癌分期、演進(jìn)相關(guān)的代謝途徑，并證明了LPC（18:0）對(duì)抑制SW480增殖具有生物學(xué)功能。

進(jìn)一步的，利用多種機(jī)器學(xué)習(xí)方法對(duì)346例匹配的結(jié)直腸癌組織和正常組織樣本的代謝分子進(jìn)行篩選、預(yù)測(cè)和數(shù)據(jù)集間的交叉驗(yàn)證，得出了7個(gè)代謝物組合的預(yù)測(cè)模型，該模型具有較高的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性（87.74%）、特異性（89.66%）和敏感性（85.82%），準(zhǔn)確區(qū)分了正常組織和癌癥組織，獲得了分子功能集群的可視化結(jié)直腸癌早期診斷模型。并開(kāi)展了多組學(xué)數(shù)據(jù)的關(guān)聯(lián)分析和富集分析，發(fā)現(xiàn)PC（30:0）具有重要診斷價(jià)值，探討與其相關(guān)性較強(qiáng)的基因變化；進(jìn)行分子集群的功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示PC（30:0）可以促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480的增殖，揭示了癌癥中基因變化和代謝失調(diào)之間的關(guān)聯(lián)性。此外，利用空氣動(dòng)力輔助解吸電噴霧離子化質(zhì)譜成像系統(tǒng)進(jìn)行了結(jié)直腸癌組織的質(zhì)譜成像實(shí)驗(yàn)，通過(guò)可視化信息闡明了組織切片中的特征分子分布和空間信息，并發(fā)現(xiàn)特征標(biāo)志物中包含了iEESI-MS方法所篩查到的7個(gè)代謝特征離子，證明了iEESI-MS方法和診斷模型的準(zhǔn)確性。最終形成了功能分子–關(guān)聯(lián)基因–代謝失調(diào)–可視化信息選

擇的交互驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)，完善了用于早期診斷的可視化分子集群。

（二）血漿樣品分析

為建立可視化早期診斷模型，提出了血漿樣本“部分–整體”的研究策略。把早期結(jié)直腸癌看作“部分”，結(jié)直腸癌認(rèn)為是“整體”，將“部分”和“整體”相結(jié)合，分析了130例血漿樣本的代謝譜圖，以描述結(jié)直腸癌和早期結(jié)直腸癌之間異常代謝的一致性。并通轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)了一條以脂質(zhì)代謝為中心的異常變化途徑，通過(guò)探究影響早期和進(jìn)展期結(jié)直腸癌的特定和共同變化的代謝途徑，最終確定了影響結(jié)直腸癌發(fā)展的代謝標(biāo)志物，并驗(yàn)證了油酸和FA(18：2(10E, 12Z))等分子可以促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，可作為早期結(jié)直腸癌的血漿診斷工具。

免疫細(xì)胞的改變與關(guān)鍵代謝標(biāo)志物分子

收集健康人和癌癥患者血漿，分選獲得T、B、NK和巨噬細(xì)胞，篩查兩組相同免疫細(xì)胞間的差異代謝物，探究在直腸癌進(jìn)展過(guò)程中免疫細(xì)胞的改變與關(guān)鍵代謝小分子的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)煙酰甘氨酸化合物在癌癥組的T、B、NK、巨噬細(xì)胞中水平均升高，推斷煙酰甘氨酸可能是潛在的診斷標(biāo)志物。用煙酰甘氨酸干預(yù)SW480和CT26細(xì)胞培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其能夠促進(jìn)人和鼠結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，并進(jìn)一步驗(yàn)證煙酰甘氨酸對(duì)機(jī)體的免疫抑制作用。此外，建立了CT26皮下結(jié)直腸癌模型，并利用煙酰甘氨酸進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)煙酰甘氨酸顯著促進(jìn)了小鼠結(jié)直腸腫瘤體積的增大，可能是潛在的診斷標(biāo)志物。

（四）開(kāi)發(fā)新型特異性阻斷劑及反向驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

基于前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)LPC（18:0） 的含量在結(jié)直腸癌組織中顯著低于正常組織，是潛在的診斷標(biāo)志物。因此提出假說(shuō)：提高機(jī)體LPC（18:0）的水平可能會(huì)抑制結(jié)直腸癌的發(fā)展。為了驗(yàn)證LPC（18:0）對(duì)結(jié)直腸癌的影響，用不同濃度的LPC（18:0）處理結(jié)直腸癌CT26細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)LPC（18:0）顯著抑制了CT26細(xì)胞增殖。提取細(xì)胞總RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組RNA-seq，結(jié)果表明LPC（18:0）顯著抑制了脂質(zhì)代謝通路和甘油磷脂通路。驗(yàn)證LPC（18:0）的體內(nèi)治療效果：建立了小鼠CT26結(jié)直腸癌治療模型，發(fā)現(xiàn)LPC（18:0）顯著抑制了小鼠結(jié)直腸腫瘤的生長(zhǎng)，降低腫瘤細(xì)胞中PCNA的表達(dá)。

iEESI-MS測(cè)定所收集的小鼠血液中的代謝標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)給藥后的小鼠血液中脂質(zhì)代謝通路及甘油磷脂通路被顯著抑制。為了驗(yàn)證LPC（18:0）是否對(duì)早期結(jié)直腸有干預(yù)作用，進(jìn)一步建立了AOM/DSS誘導(dǎo)的小鼠原發(fā)結(jié)直腸癌模型，利用LPC（18:0）在不同時(shí)期進(jìn)行干預(yù)；與對(duì)照組數(shù)據(jù)相比，LPC（18:0）顯著抑制了經(jīng)AOM/DSS誘導(dǎo)的早期癌癥病灶位點(diǎn)數(shù)量，并且顯著降低了小鼠早期結(jié)直腸的病理特征，認(rèn)為L(zhǎng)PC（18:0）可能是一種潛在的代謝阻斷劑，能用于結(jié)直腸癌的治療及早期預(yù)防。

（五）基于混沌和分型理論運(yùn)算的早期診斷可視化干圖案的建立

混沌映射作為非線性理論的一種，具備初值敏感性、偽隨機(jī)性和不可預(yù)測(cè)性等特點(diǎn)，這與癌癥發(fā)生、發(fā)展的演變特征相貼合。本項(xiàng)目首創(chuàng)性的以混沌與分形的理論為指導(dǎo)，利用數(shù)學(xué)模型發(fā)現(xiàn)分子變化規(guī)律，繪制癌癥發(fā)展和診斷的干圖案?？紤]到質(zhì)譜數(shù)據(jù)規(guī)模體量，并兼顧任務(wù)對(duì)特征權(quán)重的需要，選擇神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和洛倫茲方程進(jìn)行運(yùn)算，將前期實(shí)驗(yàn)獲得的差異性標(biāo)志物離子作為引子，達(dá)到預(yù)測(cè)概率盡可能接近實(shí)際觀測(cè)值的類別，初步探索了結(jié)直腸癌早期診斷的可視化干圖案的運(yùn)算模型。

(六) 光譜可視化診療方法的研究

此外，在前期代謝分子和代謝通路機(jī)制研究的基礎(chǔ)上，開(kāi)展了腫瘤可視化診療工作。探究光譜可視化在腫瘤診療中的研究，利用NIR熒光成像引導(dǎo)的光動(dòng)力和鐵死亡的協(xié)同診療，實(shí)現(xiàn)了單組分有機(jī)光敏劑同時(shí)作為I型光動(dòng)力試劑和非金屬的鐵死亡誘導(dǎo)劑用于光動(dòng)力–鐵死亡的活體可視化協(xié)同治療。建立靶向線粒體的高效光動(dòng)力和光熱協(xié)同診療體系，實(shí)現(xiàn)單組分有機(jī)光敏劑能夠用于NIR-FLI和光熱成像引導(dǎo)的高效PDT和PTT的活體腫瘤多模態(tài)可視化協(xié)同診療。

綜上，本項(xiàng)目通過(guò)iEESI-MS和UHPLC-MS技術(shù)全面分析了結(jié)直腸癌血漿、組織和細(xì)胞的代謝特征及代謝途徑，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法或機(jī)器學(xué)習(xí)等數(shù)據(jù)分析方法篩查具有診斷性能的生物標(biāo)志物，將早期診斷結(jié)果進(jìn)行可視化的模型呈現(xiàn)；并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)以及細(xì)胞生物實(shí)驗(yàn)對(duì)潛在的生物標(biāo)志物進(jìn)行綜合分析和驗(yàn)證，揭示了關(guān)于癌癥進(jìn)展的關(guān)鍵功能代謝分子標(biāo)志物，并建立了小鼠結(jié)直腸癌模型對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證；根據(jù)混沌分形理論構(gòu)建了結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程的干圖案，可視化的闡述了癌癥的演進(jìn)過(guò)程和生長(zhǎng)路線，為結(jié)直腸癌的早期可視化診斷和干預(yù)提供了一個(gè)全新的研究視角。

三、研究成果

本項(xiàng)目申報(bào)發(fā)明專利 2 項(xiàng)，發(fā)表 15 篇 SCI 論文，培養(yǎng)畢業(yè)博士和碩士研究生 14 人。

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