前言：

人體低溫保存作為一種可能實(shí)現(xiàn)“復(fù)活”的新技術(shù)，受到了越來越多的關(guān)注。就目前的技術(shù)而言，人體低溫保存更像是一張未來才能兌換的支票，因?yàn)槿梭w復(fù)溫是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，當(dāng)前的技術(shù)手段無法使復(fù)溫后的人體恢復(fù)如初。隨著諸如納米技術(shù)、仿生型低溫保存技術(shù)等新科技的涌現(xiàn)，人體低溫保存的技術(shù)瓶頸有望在未來被攻破。

古代能夠輕易奪走生命的傷寒，現(xiàn)在只需要幾粒藥丸便能治愈，醫(yī)學(xué)的發(fā)展使得許多“不治之癥”成為過去，但是如何才能讓已經(jīng)處于生命邊緣的人吃到“未來之藥”呢？人們求助于人體低溫保存技術(shù)。2017年5月，因患肺癌離世的展文蓮在山東齊魯醫(yī)院和銀豐生命科學(xué)研究院的共同協(xié)助下完成了中國第一例人體低溫保存，期望將來通過一定的科技手段“復(fù)活”，重新獲得健康。

不同冷凍速度下的細(xì)胞低溫保存

何謂人體低溫保存

低溫生物學(xué)是一門研究低溫條件下（0℃以下或者接近0℃）生命現(xiàn)象以及生物體保存的科學(xué)。1949年，英國生物學(xué)家波爾熱（C. Polge）和史密斯（A. U. Smith）偶然發(fā)現(xiàn)精子在甘油溶液中可以經(jīng)歷低溫冷凍而不死亡，使低溫保存作為低溫生物學(xué)的一個(gè)重要研究方向登上歷史舞臺(tái)。低溫保存是指將活的生物體（細(xì)胞、組織、器官，甚至活的生物有機(jī)體）采用特殊的方法冷卻到非常低的溫度（一般為－80℃/－196℃），并短期/長期保存，待需要時(shí)，再將生物體按特殊的方法解凍，恢復(fù)到正常溫度，獲得正常生命體征的生物體。低溫可以抑制生物體的生化活動(dòng)，使其可以在低溫下長期保存。按照阿倫尼烏斯公式（Arrhenius equation）估算溫度對(duì)生化反應(yīng)速度的影響，若一生物體在4℃下能存活2小時(shí)，則其在－40℃下可保存數(shù)日，－80℃下可保存數(shù)月，－196℃下甚至可以保存幾個(gè)世紀(jì)。在－196℃的低溫下，生物體代謝基本停止，避免了由遺傳引起的生物變異。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的人希望通過人體低溫保存技術(shù)得以“永生”?；加鞋F(xiàn)代醫(yī)學(xué)無法醫(yī)治疾病的人希望通過在低溫下保存自己的身體（通常在－196℃液氮中），在未來醫(yī)學(xué)發(fā)達(dá)的時(shí)候能夠成功復(fù)溫并使自己的疾病得以治療，再次獲得生命。1967年，美國心理學(xué)家貝德福德（J. Bedford）成為世界上第一個(gè)被低溫保存的人；2015年我國作家杜虹在美國Alcor生命延續(xù)基金會(huì)（Alcor Life Extension Foundation）通過低溫保存了大腦，是首例我國公民接受低溫保存的案例；2017年5月，我國首例人體全身低溫保存手術(shù)由銀豐生命科學(xué)研究院完成。截至2017年8月，作為全球最具代表性的兩家人體冷凍公司：美國Alcor生命延續(xù)基金會(huì)和美國人體冷凍機(jī)構(gòu)（Cryonics Institute）已經(jīng)分別凍存了152 [1]和153 [2]名客戶。但是，目前全球范圍內(nèi)尚未有一例凍存后的人體成功復(fù)溫，并重新獲得生命的案例。

卵巢組織玻璃化冷凍前后比較 (a)玻璃化冷凍前；(b)玻璃化冷凍后[8]。

人體低溫保存方案

根據(jù)美國Alcor生命延續(xù)基金會(huì)的人體低溫保存方案 [3]，理想情況下，在人體心臟停止跳動(dòng)后，等候的工作人員迅速利用生命支持技術(shù)來維持其腦活力。這些生命支持技術(shù)包括在將人體置于冰水浴中（低溫抑制新陳代謝）的同時(shí)，人工恢復(fù)其血液循環(huán)和呼吸，為大腦提供氧合血的同時(shí)增強(qiáng)冷卻；通過靜脈注射施用包括自由基抑制劑、抗凝血藥、升壓藥等保護(hù)性藥物以保持血壓，改善循環(huán)，抑制血液凝固并保護(hù)大腦。當(dāng)體溫降低到接近水的冰點(diǎn)時(shí)，進(jìn)行冷凍保護(hù)劑灌注。在此之前，為清洗血液，在0℃以下將一種基礎(chǔ)灌注液注入人體血液循環(huán)系統(tǒng)中，循環(huán)數(shù)分鐘。為使?jié)B透壓最小，以及提供足夠的時(shí)間使冷凍保護(hù)劑滲透到細(xì)胞內(nèi)，在接下來的兩個(gè)小時(shí)內(nèi)，將冷凍保護(hù)劑的濃度以線性速率增加到目標(biāo)濃度的一半，并注入血液循環(huán)系統(tǒng)中。最后，在1個(gè)小時(shí)內(nèi)，迅速把冷凍保護(hù)劑的濃度增加到目標(biāo)濃度。灌注冷凍保護(hù)劑后，系統(tǒng)在計(jì)算機(jī)控制下，將人體在3個(gè)小時(shí)內(nèi)冷卻至－124℃，以避免冰晶的形成。在接下來的兩周內(nèi)，人體被進(jìn)一步冷卻到－196℃，并被轉(zhuǎn)移到液氮中進(jìn)行長期保存。

電影《太空旅客》中的人體冷凍艙

人體低溫保存的技術(shù)瓶頸

生物體雖然能在低溫下長期保存，但是在冷凍和復(fù)溫過程中非常容易受到損傷，而這個(gè)損傷基本上發(fā)生在－60℃~0℃這段溫度范圍內(nèi)。根據(jù)低溫物理學(xué)家梅熱（P. Mazur）等人提出的“兩因素假說”，常溫下，細(xì)胞內(nèi)液和細(xì)胞外液處于等溫和等滲的狀態(tài)，但在冷凍和復(fù)溫過程中，由于傳熱和傳質(zhì)速率的不同，會(huì)造成細(xì)胞冰晶形成的大小、形狀、位置等的不同，從而對(duì)細(xì)胞造成“溶質(zhì)損傷”或“胞內(nèi)冰損傷”。冰晶會(huì)刺穿、擠壓細(xì)胞膜、細(xì)胞器等，并且胞內(nèi)冰的形成使細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)濃度升高，pH變化，進(jìn)而引起部分蛋白質(zhì)的變性以及溶酶體的損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。所以，在不同的生物體低溫保存過程中，需要獲得其“最佳冷凍速率”。該速率既可以防止胞內(nèi)冰形成，又能將“溶質(zhì)損傷”降到最小，以提高細(xì)胞低溫保存后的恢復(fù)率。

為減少0℃以下冰的形成對(duì)生物體的機(jī)械損傷，冷凍保護(hù)劑常被配制成一定濃度的溶液。甘油是人類最早發(fā)現(xiàn)的冷凍保護(hù)劑，在早期的冷凍方案中常見到。但是由于其滲透速率慢，冷凍效果不理想，已逐漸被取代。二甲基亞砜（DMSO）是第一種用于人類胚胎保存的冷凍保護(hù)劑，其滲透速率快，可以快速穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，降低冰點(diǎn)，延緩凍存過程，同時(shí)提高細(xì)胞內(nèi)離子濃度，減少胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少細(xì)胞損傷。深低溫時(shí)DMSO的細(xì)胞毒性受到抑制，但是當(dāng)高于4℃時(shí)，長時(shí)間暴露于DMSO中會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷且DMSO會(huì)誘導(dǎo)干細(xì)胞分化 [5]。目前研究者正致力于發(fā)展慢速冷凍—快速解凍方案中可以替代DMSO的冷凍保護(hù)劑。比如，海藻糖對(duì)生物抗脫水、抗冷凍、抗高滲有積極作用，對(duì)生物膜、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子也發(fā)揮著保護(hù)的功效；脯氨酸不僅能夠穩(wěn)定生物大分子結(jié)構(gòu)，降低細(xì)胞酸性，調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原電位匯，而且作為細(xì)胞的滲透型冷凍保護(hù)劑，能夠降低冰點(diǎn)，防止細(xì)胞脫水 [6]。所以，尋找生物友好型冷凍保護(hù)劑及合適的冷凍保護(hù)劑組合對(duì)于生物體的成功低溫保存及復(fù)蘇是極其關(guān)鍵的。

冷凍方法主要分為標(biāo)準(zhǔn)程序化冷凍和玻璃化冷凍。近些年，玻璃化冷凍由于在保存過程中不產(chǎn)生冰晶，受到了越來越多的關(guān)注。它是一種利用高濃度冷凍保護(hù)劑溶液的超速凍存生物體的方法，實(shí)施冷凍保存過程中快速降溫及升溫，才有可能實(shí)現(xiàn)成功的玻璃化冷凍。目前該技術(shù)在細(xì)胞尺度上可以較為成功地實(shí)施。但是當(dāng)生物體體積增大時(shí)，實(shí)施起來就會(huì)有較大困難。由佩內(nèi)斯生物傳熱方程（Pennes bio-hent equation）可知，當(dāng)血液灌注率及人體代謝產(chǎn)熱停滯時(shí)，熱流密度正比于熱導(dǎo)率和溫度差。由于人體組織導(dǎo)熱率較小，若使大量冷量快速傳輸?shù)饺梭w，就一定會(huì)產(chǎn)生較大的溫度差，最終造成生物體內(nèi)部溫度梯度增大，進(jìn)而引起冰核的形成和生長。此外，復(fù)溫時(shí)，在大體積的生物體中極易引起重結(jié)晶。塞基（S. Seki）研究表明，對(duì)于實(shí)行玻璃化冷凍的生物材料，在復(fù)溫過程減少再結(jié)晶的方法之一便是提高復(fù)溫速率，減少冷凍保護(hù)劑在重結(jié)晶危險(xiǎn)溫度區(qū)域停留的時(shí)間，使冷凍保護(hù)劑從玻璃化狀態(tài)直接轉(zhuǎn)化為液態(tài)。但是，同樣由于人體體積與熱導(dǎo)率的特點(diǎn)，這一點(diǎn)實(shí)現(xiàn)起來困難重重。可見，在冷凍與復(fù)溫過程中所遭受的雙重破壞下，組織、器官及人體的低溫保存是極其困難的。

相對(duì)于細(xì)胞、組織、器官來說，人體的生命結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜。尤其像人腦這樣復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，有1000億個(gè)神經(jīng)元及1萬個(gè)神經(jīng)連接，冷凍保存時(shí)極易受到損傷，低溫保存后的大腦所擁有的記憶是否能夠保存也未可知。

低溫保存發(fā)展現(xiàn)狀

人體結(jié)構(gòu)由微觀到宏觀可以分為細(xì)胞、組織、器官、系統(tǒng)與人體五個(gè)層次，低溫保存的終極目標(biāo)是實(shí)現(xiàn)人體長期的低溫保存并復(fù)蘇。就目前的科技水平而言，實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)任重而道遠(yuǎn)，但低溫保存領(lǐng)域仍有著廣泛的應(yīng)用。

細(xì)胞低溫保存已經(jīng)在醫(yī)學(xué)中發(fā)揮著重要作用。例如，人類卵母細(xì)胞冷凍作為生育力保存的途徑之一，已經(jīng)在輔助生殖技術(shù)中扮演著不可或缺的角色。而卵母細(xì)胞的冷凍技術(shù)，特別是冷凍方式和冷凍保護(hù)劑，經(jīng)過多年的發(fā)展取得了較大的進(jìn)步。越來越多的實(shí)驗(yàn)研究表明，玻璃化冷凍具有更好的冷凍保存效果，格盧約夫斯基（D. Glujovsky） 等人在2014年的研究中，對(duì)106名患者進(jìn)行了隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)，結(jié)果顯示玻璃化冷凍與慢速冷凍相比具有更高的妊娠率 [7]。

構(gòu)成人體的細(xì)胞有200多種，各種細(xì)胞間都存在著較大的差異，如每種細(xì)胞的體積不同，組織滲透率和導(dǎo)熱性能也不同，因此，最佳的冷凍速率和冷凍保護(hù)劑也因細(xì)胞種類的不同而不同。由多種不同細(xì)胞構(gòu)成的組織具有更加復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和更大的體積，這無疑增加了組織在冷凍過程中熱量傳遞和保護(hù)劑傳遞的難度，因此組織低溫保存相較于細(xì)胞低溫保存而言，效果較差，難度更大。不過，隨著近幾十年低溫生物傳熱研究的迅速發(fā)展，組織低溫保存在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域也已能施展一定的“拳腳”。以生殖醫(yī)學(xué)為例，早在2004年，多內(nèi)（J. Donnez）等人就利用慢速冷凍法保存了一名淋巴癌患者的卵巢組織，并且在解凍后實(shí)現(xiàn)了自體盆腔移植，最后使患者成功分娩一名女嬰。根據(jù)西爾伯（S. Silber） 提供的數(shù)據(jù)顯示，到2016年為止，全球有70多個(gè)嬰兒依靠卵巢移植技術(shù)降生，其中西爾伯小組共進(jìn)行了13例卵巢冷凍移植手術(shù)，最終順利產(chǎn)下9名嬰兒，成活率超過70%[8]。

不過，低溫保存的“威力”也僅限于此。對(duì)于離體器官而言，目前只能實(shí)現(xiàn)短期保存，以臨床保存經(jīng)驗(yàn)最多的腎臟為例，用機(jī)器持續(xù)低溫灌洗法僅僅可以安全保存3天。如前所述，樣本體積較大時(shí)，冷凍與復(fù)溫過程中熱量難以均勻?qū)耄罱K導(dǎo)致冷凍與復(fù)溫的結(jié)果并不理想。2017年，比斯科夫（J. C. Bischof）研究團(tuán)隊(duì)在冷凍保護(hù)劑中加入介孔二氧化硅包被的氧化鐵納米顆粒，通過射頻激發(fā)加熱，使整個(gè)樣品受熱更加快速均勻，成功實(shí)現(xiàn)了玻璃化冷凍的最高80毫升物理系統(tǒng)及50 毫升生物系統(tǒng)的復(fù)蘇。比斯科夫表示，該技術(shù)克服了移植醫(yī)學(xué)中的一個(gè)重大障礙，或使器官低溫保存成為現(xiàn)實(shí)，其應(yīng)用前景非常樂觀。目前，動(dòng)物器官相關(guān)實(shí)驗(yàn)已在進(jìn)行中，很有可能在未來7~10年內(nèi)開始人類器官低溫保存實(shí)驗(yàn) [9]。盡管從理論上講，該技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)整個(gè)冷凍器官快速復(fù)溫，但是還有很多問題需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

經(jīng)過幾百萬年的進(jìn)化，許多生物體已經(jīng)具有忍受機(jī)體凍結(jié)的能力。例如，阿拉斯加木蛙（Rana sylvatica）已被證實(shí)可以在低至－16℃的溫度下凍結(jié)，并在－4℃下忍受2個(gè)月的凍結(jié)期 [10]。當(dāng)面對(duì)寒冷刺激時(shí)，南極線蟲（Panagrolaimus davidi）能產(chǎn)生穩(wěn)定細(xì)胞膜的海藻糖及抑制重結(jié)晶的蛋白質(zhì)，最高可以耐受高達(dá)82％體液的凍結(jié) [11]。這些現(xiàn)象拓寬了研究人員的思路，即通過研究自然界中能忍受凍結(jié)的生物體所采用的生物學(xué)機(jī)制，尋找更好的冷凍保護(hù)劑及低溫保存方法。早在十多年前，就有科學(xué)家提出，將冷凍保護(hù)劑進(jìn)行活體加載，人為地使冷凍保護(hù)劑參與生物體的生命活動(dòng)，之后再對(duì)其實(shí)施低溫凍存 [12]。研究人員在研究抗凍生物體合成的抗凍蛋白等生物友好型冷凍保護(hù)劑的冷凍保護(hù)機(jī)制中，從生物體（尤其是抗凍魚類、昆蟲等）中分離提純抗凍蛋白，用于低溫保存領(lǐng)域，取得了較為理想的效果。在2012年的一項(xiàng)研究中，科研人員用富含脯氨酸的食物喂養(yǎng)對(duì)寒冷敏感的黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）幼蟲，使其組織中積聚脯氨酸，再將這些果蠅進(jìn)行低溫保存實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，果蠅在－5℃時(shí)，能夠忍受大約50％的體液冷凍，并且復(fù)蘇后其生命活動(dòng)也沒有受到影響 [13]。

可以預(yù)見的是，借鑒動(dòng)物天然的耐寒機(jī)理，效法自然，發(fā)展仿生型低溫保存技術(shù)，將成為今后突破人體低溫保存技術(shù)瓶頸的最有前景的方向之一。

總之，人體低溫保存技術(shù)目前并不十分成熟，盡管有越來越多的人體被低溫保存，但是各大保存機(jī)構(gòu)也承認(rèn)無法兌現(xiàn)復(fù)活時(shí)間，要成功實(shí)現(xiàn)復(fù)活不僅要面對(duì)宗教、法律、倫理方面的挑戰(zhàn)，更受到諸多科學(xué)技術(shù)的限制。目前不僅需要解決冷凍及復(fù)溫過程中造成的細(xì)胞損傷、冷凍保護(hù)劑毒性等難題，還需探索合適的冷凍和復(fù)溫過程，解決復(fù)蘇后的生物學(xué)問題（如大腦記憶的恢復(fù)），一步步地從離體細(xì)胞、組織、器官、小動(dòng)物、大動(dòng)物的低溫保存開展深入嚴(yán)謹(jǐn)?shù)难芯?，這將是一條漫長的科學(xué)探索之路。

作者簡介：

中國科學(xué)院理化技術(shù)研究所低溫工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，竇蒙家，碩士研究生；張明寬，碩士研究生；饒偉，研究員；劉靜，研究員。

參考文獻(xiàn)：

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（原標(biāo)題為《人體低溫保存：通向未來“永生”之路?》）

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