編譯：微科盟蔚藍，編輯：微科盟居居、江舜堯。

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導讀  

微生物群落由具有不同代謝能力的細胞組成，通常包括缺乏必要代謝途徑的營養(yǎng)缺陷型。通過分析來自地球微生物組計劃(EMP)的一部分而獲得的12000多個天然微生物群落的微生物組數(shù)據(jù)中氨基酸生物合成途徑的營養(yǎng)缺陷型，以及自我建立的代謝合作酵母群落(SeMeCos)中營養(yǎng)缺陷型-原養(yǎng)型相互作用的研究，研究者揭示了一種代謝印跡機制，這一機制將營養(yǎng)缺陷型的存在與代謝相互作用的增加和抗菌藥物耐受性的提高聯(lián)系起來。由于攝取特定代謝物所必需的代謝適應，營養(yǎng)缺陷型的代謝通量分布改變降低了細胞內(nèi)藥物濃度，使細胞能在藥物濃度高于最低抑制濃度的情況下生長。例如，我們發(fā)現(xiàn)在從代謝豐富的環(huán)境中攝取代謝物的酵母細胞中，唑類藥物的抗真菌作用大大減弱。因此，本研究的結果提供了一種可解釋為什么細胞在代謝相互作用時對藥物暴露抵抗力更強的機制。

論文ID

原名：Microbial communities form rich extracellular metabolomes that foster metabolic interactions and promote drug tolerance

譯名：微生物群落形成豐富的細胞外代謝組，促進代謝相互作用并提高藥物耐受性

期刊：Nature Microbiology

IF：30.964

發(fā)表時間：2022.3

通訊作者：Markus Ralser，Mohammad Tauqeer Alam

通訊作者單位：英國弗朗西斯·克里克研究所；阿聯(lián)酋大學

DOI號：10.1038/s41564-022-01072-5      

實驗設計

結果

1.氨基酸營養(yǎng)缺陷型在自然群落中普遍存在    

利用來自EMP的物種組成數(shù)據(jù)，我們分析了獨立生存和宿主相關的自然群落中營養(yǎng)缺陷型的頻率。我們使用Machado等人描述的方法確定了營養(yǎng)缺陷的發(fā)生。對EMP 數(shù)據(jù)集中＞12000個群落的研究表明，獨立生存和宿主相關的群落都包含高頻率的氨基酸生物合成途徑的營養(yǎng)缺陷型物種。事實上，數(shù)據(jù)顯示（氨基酸）營養(yǎng)缺陷型的存在幾乎是微生物群落的普遍特征。該數(shù)據(jù)集中的12538個群落中僅有6個不含氨基酸營養(yǎng)缺陷型，而一個群落中不包含單個例子。此外，許多群落中都包含高頻率營養(yǎng)缺陷型，特別是在宿主相關的群落中，我們觀察到相對于原養(yǎng)型微生物，營養(yǎng)缺陷型物種的豐度特別高（45.55% vs 25.88%在獨立生存的群落中；圖1a）。我們推測宿主相關的物種暴露于豐富的營養(yǎng)環(huán)境中，這可能解釋了為什么營養(yǎng)缺陷型更占優(yōu)勢。

圖1 營養(yǎng)缺陷型在宿主相關微生物群落中普遍存在，且更具抗藥性。

a，在EMP中測序的<12000個微生物群落中氨基酸營養(yǎng)缺陷型物種的頻率。虛線表示給定微生物群落中1:1的營養(yǎng)缺陷型/原養(yǎng)型微生物(A:P)比率。b，在暴露于1197種生物活性藥物的40種腸道微生物中檢測到的氨基酸營養(yǎng)缺陷型的數(shù)量為15。c，以AUC代表藥物暴露微生物組物種中原養(yǎng)型和營養(yǎng)缺陷型間的生長。微生物-藥物對根據(jù)40種藥物暴露微生物物種生長的強(AUC > 0.2)、弱 (0.9 > AUC > 0.2) 和無影響 (AUC > 0.9) 進行分類。d, SeMeCos，一種用于研究營養(yǎng)缺陷型亞群的基于酵母的等基因模型。e，上，左下：SeMeCo菌落暴露于900種FDA批準的藥物。z值的PCA，評估其對群落組成的影響。分層聚類確定了影響A:P比率的兩個藥物簇（黃色和灰色）。箭頭表示由營養(yǎng)缺陷型亞群驅動的方差。右下：PCA鑒定的強唑類藥物的腸道微生物組AUC值的子集。f，基于最高z值的藥物治療SeMeCos內(nèi)的A:P比率。這些藥物的分類基于已知的靶點/活性。g，用不存在于e中的唑類/他汀類藥物治療的SeMeCos的成分分析。A:P比率的變化以紅色和藍色突出顯示。數(shù)據(jù)為一個獨立實驗中n=3 次技術重復的中位數(shù)。h，藥物治療后原養(yǎng)型和營養(yǎng)缺陷型亞群的比例。使用雙邊t檢驗確定顯著性，* P< 0.05, ** P< 0.005，**** P< 0.00005。    

2.氨基酸營養(yǎng)缺陷型不易受藥物影響    

同樣，與宿主相關的群落更頻繁地暴露于生物活性藥物，包括那些針對人類、真菌或細菌細胞的藥物，這些藥物可影響宿主微生物組的組成。為了測試營養(yǎng)缺陷型是否會對這些藥物反應產(chǎn)生任何影響，我們利用了暴露于1197種生物活性藥物的40個腸道微生物組成員的生長數(shù)據(jù)。為確定這40個腸道微生物組物種中營養(yǎng)缺陷型物種的存在，我們使用了相同的預測器，發(fā)現(xiàn)40個物種中有15個（37.5%）在12種氨基酸生物合成途徑中的確存在營養(yǎng)缺陷型（圖1b）。單個物種最多同時擁有7種氨基酸營養(yǎng)缺陷型，在不同組合中大多數(shù)具有1到4種。為說明藥物對微生物物種生長的影響，我們將其分為三類：(1) 應用藥物對生長的強烈影響（n=3100藥物-微生物對，單側Wilcoxon秩和檢驗，錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)校正P=5.4×10–9；(2) 藥物對生長的弱影響（n=5461藥物-微生物對，單側Wilcoxon秩和檢驗，F(xiàn)DR校正P?=2.0 × 10–15）；(3) 藥物對生長沒有影響(n?=39264藥物-微生物對）。我們使用從生長曲線中獲得的平均曲線下面積(AUC)值的差異，其中對于Maier等人描述的“無生長效應”類別，AUC值被歸一化為1 (圖1c)。與原養(yǎng)型微生物相比，營養(yǎng)缺陷型通常在所選藥物存在的情況下生長得更好（表現(xiàn)為更高的AUC值）。在8561種藥物-微生物組合中檢測到營養(yǎng)缺陷型的生長較原養(yǎng)型強（圖1c）。雖然其他藥物對營養(yǎng)缺陷型沒有影響（圖1c，底部），但我們并未發(fā)現(xiàn)一種藥物類別會使營養(yǎng)缺陷型較原養(yǎng)型處于劣勢。營養(yǎng)缺陷型的作用在對生長有抑制作用的藥物組中最為普遍，但在對生長沒有普遍影響的藥物組中則不明顯，這表明氨基酸營養(yǎng)缺陷型可以緩沖生長抑制藥物治療的影響（圖1c）。特別是，氨基酸營養(yǎng)缺陷型對靶向細菌、真菌和原生動物的藥物更具抗性（Wilcoxon秩和檢驗；圖1c）。    

3.代謝合作的營養(yǎng)缺陷型更具耐藥性    

對于廣譜的藥物類型和靶標，觀察到藥物暴露后與原養(yǎng)型相比營養(yǎng)缺陷型的生長改善。這一發(fā)現(xiàn)暗示了一種將氨基酸營養(yǎng)缺陷與微生物藥物反應聯(lián)系起來的普遍的、與靶標無關的機制。為了闡明這種機制，我們尋求一種易于處理的等基因模型，在該模型中藥物耐受性的差異很容易直接歸因于營養(yǎng)缺陷型突變。SeMeCos代表了一種可追蹤營養(yǎng)缺陷型亞群并詳細剖析營養(yǎng)缺陷型-原養(yǎng)型相互作用的酵母模型。在SeMeCos中，單個原養(yǎng)型生成細胞的隨機質(zhì)粒丟失會產(chǎn)生一個營養(yǎng)缺陷型和原養(yǎng)型微生物組成的群落，其中營養(yǎng)缺陷型的生存和生長需要氨基酸（組氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸）和核堿基（尿嘧啶）的交換（圖1d）。新興的營養(yǎng)缺陷亞群可以被追蹤，因為SeMeCos菌落呈指數(shù)增長，通過在適宜培養(yǎng)基上生長來檢測營養(yǎng)缺陷，或者將分離的代謝標記物與熒光蛋白偶聯(lián)并通過顯微鏡和熒光激活細胞分選(FACS)識別營養(yǎng)缺陷。在本研究中，SeMeCos具有與腸道微生物物種相似數(shù)量的營養(yǎng)缺陷型，并且受影響的途徑相似：15種營養(yǎng)缺陷型腸道物種中的13種以及SeMeCos在不同組合中具有1到4種氨基酸營養(yǎng)缺陷。    

為了研究SeMeCos中的營養(yǎng)缺陷型是否復制了在細菌營養(yǎng)缺陷型中觀察到的對藥物暴露增加的穩(wěn)健性，我們首先生成了一個SeMeCos菌株，該菌株與經(jīng)密碼子優(yōu)化以在酵母中表達的熒光蛋白共表達原養(yǎng)型標記酶His3p、Leu2p、Met15p和Ura3p。然后，我們通過連續(xù)定位從原始菌株中建立SeMeCos群落，并將它們暴露于包含900種不同的FDA批準藥物的化合物庫中，這些藥物在許多藥理學篩選中的典型濃度為10 μM。在這些藥物中有240種也在腸道微生物群中進行測試，其中179種具有生長抑制作用。在基本綜合培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞 24小時后，我們使用高通量熒光成像來確定培養(yǎng)物的營養(yǎng)缺陷型組成。對于每種藥物條件下的每個營養(yǎng)缺陷亞群，指定了一個z值來反映與賦形劑對照(DMSO)群體中位數(shù)的偏差程度。原始值的主成分分析（PCA）和前兩個成分的層次聚類顯示出三個集群（圖1e）。集群1包含對SeMeCos組成沒有影響的賦形劑對照（DMSO）和藥物治療，與集群2和3相反，這主要反映了與營養(yǎng)缺陷的數(shù)量或類型無關的營養(yǎng)缺陷增加（圖1e，箭頭）。有助于集群2和集群3的大多數(shù)藥物都是抗微生物/抗真菌化合物，并且在集群2藥物的一個子集中，營養(yǎng)缺陷型在腸道微生物組藥物篩選中也表現(xiàn)出生長改善（圖1e、f）。值得注意的是，營養(yǎng)缺陷型對唑類藥物治療的穩(wěn)健性（SeMeCos藥物篩選中的10/42藥物），這是一類臨床用于治療真菌感染的化合物，靶向麥角甾醇生物合成途徑（圖1e；Wilcoxon秩和檢驗, P=5.3×10–4）。為在獨立實驗中測試這一發(fā)現(xiàn)的普遍性，我們將SeMeCos暴露于屬于唑類和他汀類的其他化合物（另一組影響酵母中麥角甾醇生物合成途徑的化合物）。隨后我們通過流式細胞術測定了SeMeCos營養(yǎng)缺陷型組成的變化。在兩個獨立實驗中，與賦形劑對照（DMSO）相比，暴露于這兩種藥物類別的SeMeCos營養(yǎng)缺陷型亞群的數(shù)量顯著增加（圖1g，h）。為排除由于質(zhì)粒分離或穩(wěn)定性改變導致藥物反應變化的可能性，這也會影響SeMeCos中營養(yǎng)缺陷型亞群的比例，我們用另一種可供選擇的著絲粒質(zhì)粒(MitoLoc)轉化野生型(WT)細胞，使得選擇不是通過營養(yǎng)缺陷型而是通過抗生素諾爾絲菌素。此外，我們還測試了四種標記基因基因組整合的酵母菌株的耐藥性。對比WT（無質(zhì)粒）、SeMeCos（四種質(zhì)粒）以及基因組整合菌株，我們觀察到對烯效唑或咪康唑的生長反應沒有顯著差異，這表明觀察到的影響不能用藥物對質(zhì)粒分離或穩(wěn)定性的影響來解釋。綜上所述，這些結果表明，營養(yǎng)缺陷在細菌以及同基因酵母菌株中都增加了對廣泛的生物活性化合物的耐藥性，特別是唑類抗真菌藥和他汀類藥物。    

4.豐富的代謝環(huán)境促進藥物耐藥性    

利用通量平衡分析(FBA)構建酵母基因組規(guī)模的代謝模型，以繪制由營養(yǎng)缺陷型引入的群落代謝變化。為解釋細胞間氨基酸和尿嘧啶的交換，我們擴展了傳統(tǒng)的FBA方法，包括來自共享外代謝組的輸出和輸入反應，因此該模型反映了不同代謝型（代謝背景）之間的代謝相互作用，特別是在共同生長的營養(yǎng)缺陷型和原養(yǎng)型生物之間（圖2a，左）。群落模型的主要目標函數(shù)是營養(yǎng)缺陷型和原養(yǎng)型的累積生物量。分析表明，從自身合成到攝取組氨酸(H)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)和/或尿嘧啶(U)的變化不僅影響四種受干擾的生物合成途徑，而且還影響與之耦合的其他廣泛代謝通量。有趣的是，在共同環(huán)境下營養(yǎng)缺陷型與原養(yǎng)型相互作用的網(wǎng)絡重建的比較表明，總體而言，隨通量增加（通量變化>10％）營養(yǎng)缺陷型具有更多的反應。同樣，原養(yǎng)型生物中通量的減少更廣泛（t檢驗，P=7×10–4）（圖2a）。此外，與原養(yǎng)型生物相比，營養(yǎng)缺陷型釋放的代謝物譜增加（圖2a）。然后我們應用擴展的FBA方法，評估交換所有四種代謝物（H、L、U、M）SeMeCos的細胞間通量變化，并在原養(yǎng)型微生物和15種營養(yǎng)缺陷型組合之間進行成對分析。我們發(fā)現(xiàn)營養(yǎng)缺陷型的數(shù)量與通量改變的代謝途徑百分比呈正相關（通量變化>10％）。同時，我們利用FBA和最小化代謝調(diào)節(jié)(MOMA)方法在基本培養(yǎng)基中模擬了單個營養(yǎng)缺陷型菌株，并補充了所需的代謝物。FBA預測營養(yǎng)缺陷型的生長速度更快，而MOMA則與群落擴展的FBA類似，預測代謝物分泌增加。    

為了通過實驗檢驗這些預測，我們測試了增長率和外代謝組的變化。為了解決前者，我們設計了一個在單個質(zhì)粒(pHLUM)上攜帶四個標記基因的SeMeCos原始菌株。由于該菌株不能區(qū)分分離標記，其后代要么保持原養(yǎng)型，要么同時變成四種代謝物的營養(yǎng)缺陷型。然后，我們通過監(jiān)測隨時間推移的SeMeCos組成，在基本培養(yǎng)基上進行了競爭性生長實驗。原養(yǎng)型（pHLUM）菌株緩慢但始終為優(yōu)勢種群，每2天將其連續(xù)移植到固體基本培養(yǎng)基上，約3周（約250代）后在SeMeCos中占主導地位。原養(yǎng)型菌株承擔了整個群落的H、L、U和M的合成，所以在共同代謝環(huán)境中的原養(yǎng)型菌的生長速度較營養(yǎng)缺陷型有小幅度但可觀的提高。 

隨后我們采用基于高靈敏度的靶向液相色譜選擇反應監(jiān)測(LC-SRM)的代謝組學方法來測量細胞團塊以及原養(yǎng)型WT和SeMeCos周圍的外代謝組中氨基酸和尿嘧啶的濃度（圖2b)。我們發(fā)現(xiàn)，盡管群落僅能交換四種代謝物（H、L、U和M），但其在細胞內(nèi)和細胞外代謝組中都表現(xiàn)出廣泛的代謝物濃度變化。SeMeCos中三分之二的細胞是H、L、U或M營養(yǎng)缺陷型（圖2c），20種細胞外代謝物濃度（氨基酸和尿嘧啶）中有14種顯著增加（圖2c）?？傊?，這些結果表明，營養(yǎng)缺陷型的存在廣泛地改變了這些群落的代謝并導致更高的細胞外代謝物水平（圖2c）。    

我們之前的結果表明，細胞至少會以比生長所需高得多的濃度輸入細胞外氨基酸。這種代謝物的獲得可以促進耐受能力。這種情況表明，觀察到的外代謝組變化可能與藥物穩(wěn)健性增加有關。為了驗證這一假設，我們在藥物治療下將WT細胞暴露于H、L、U和M，以支持生長的濃度提供這四種代謝物，導致營養(yǎng)缺陷型和原養(yǎng)型生物攝取速率相似，從而使它們的通量分布相似。然后在固體培養(yǎng)基中通過圓盤擴散試驗(DDA)和在液體培養(yǎng)物中通過微量肉湯稀釋試驗評估MIC，以測量對唑類抗真菌劑的藥物反應。在唑類藥物存在的情況下，營養(yǎng)的補充顯著增加了WT細胞的生長，在一定程度上唑類藥物的生長抑制作用被消除了（圖2d，e）。這種表型與補充劑的生長促進作用無關，因為在未處理對照組中AUC值沒有顯著變化。此外，WT細胞對唑類的耐受性和抗性以與生長速率無關的方式隨補充代謝物濃度的增加而增加，證實了這一結果。綜上，這些結果表明，營養(yǎng)缺陷型的存在導致外代謝組代謝物濃度的增加，進而增加了細胞對藥物的耐受能力。

圖2 營養(yǎng)缺陷型促進豐富的代謝環(huán)境，增加原養(yǎng)型的藥物耐受性。

a，左：SeMeCos中由營養(yǎng)缺陷型和原養(yǎng)型亞群組成的基因組規(guī)模代謝模型（n=4，H/L/U/M群落模型）。與原養(yǎng)型相比，營養(yǎng)缺陷型代謝通量（左起第二個，P =7×10–4）、代謝物交換（右起第二個，P =0.02）和氨基酸交換（右，P ?= 0.002）數(shù)量顯著增加（變化 >10% ），顯示為箱線圖。b，由HIS3、LEU2、URA3和MET15（WT)的基因組修復產(chǎn)生的原養(yǎng)型群落與含有營養(yǎng)缺陷型的SeMeCos不同，這是因為含有四個營養(yǎng)缺陷型標記質(zhì)粒的隨機分離。c，左，中：與SM培養(yǎng)基中的WT培養(yǎng)物相比，在指數(shù)增長的SeMeCos中通過質(zhì)譜對細胞內(nèi)和細胞外代謝物進行定量。代謝物濃度被歸一化為生物量，通過OD 600處的光密度評估。使用單側Kruskal-Wallis秩和檢驗確定分組代謝物比較（箱線圖）顯著性。?使用未配對雙側Wilcoxon秩和檢驗確定單個代謝物比較（條形圖）顯著性：*P?< 0.05，** P < 0.005，*** P < 0.0005，**** P < 0.00005。右圖：通過在選擇性培養(yǎng)基上定位菌落計算得出上述分析的SeMeCos中營養(yǎng)缺陷型和原養(yǎng)型的比例。?d，在分別用烯效唑或咪康唑處理的基本(SM)或SM + HLUM補充培養(yǎng)基中WT菌落中DDA測量的耐藥性（抑制暈圈直徑）和耐受性（暈圈內(nèi)生長）。從SM或SM + HLUM和/或唑類的WT培養(yǎng)物中產(chǎn)生的DDAs。e，在烯效唑/咪康唑濃度增加和HLUM補充增加后通過OD 600評估WT酵母培養(yǎng)物的生長，并繪制AUC。    

5.原養(yǎng)型微生物代謝反應的相互作用    

一般來說微生物（尤其是酵母細胞）具有感知和攝取細胞外代謝物的能力。這種生物學環(huán)境特點表明代謝物濃度的改變（如在外代謝組中所測量的）（圖2b）可能引發(fā)營養(yǎng)缺陷型乃至群落中所有細胞的代謝反應。我們生成的SeMeCos僅包含一個編碼獨立表達的增強藍色熒光蛋白(eCFP)的分離質(zhì)粒(pH、pL、pU或pM) (圖3a)。然后我們通過FACS分離營養(yǎng)缺陷型和原養(yǎng)型并測量其蛋白質(zhì)組。同時，我們測量了在其自身間生長的經(jīng)同等處理原養(yǎng)菌的蛋白質(zhì)組（即從原養(yǎng)WT酵母菌落中分離的類似處理的細胞）（圖3a）。獲得的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)證實，基于標記酶Leu2p、Met15p和Ura3p的表達，基于CFP的SeMeCos分選成功分離了營養(yǎng)缺陷型和原養(yǎng)型種群（在所有樣品中His3p均低于檢測限）。使用這種蛋白質(zhì)組學方法，我們量化了典型酵母細胞表達的4000–5000種蛋白質(zhì)中的約1500種，覆蓋幾乎全部蛋白質(zhì)組中富含代謝酶的高豐度部分，包括Leu2p、Ura3p和Met15p。這些標記酶被鑒定為兩個群體間表達差異最大的蛋白質(zhì)（圖3b）。差異表達蛋白質(zhì)的基因集合富集分析和基因本體論(GO)分析表明，代謝關系或過程（特別是氨基酸生物合成）在差異表達的蛋白質(zhì)中富集。與營養(yǎng)缺陷型相比，原養(yǎng)型中與FBA通量變化相關的多種酶（圖2a）的表達水平較低（圖3c）。此外，與FBA分析一致的是（圖2a)，與原養(yǎng)型生物相比，營養(yǎng)缺陷型中具有更高預測通量的代謝途徑（例如，V、L和I生物合成），包含許多在營養(yǎng)缺陷型中表達更高的酶。類似地，許多在原養(yǎng)型生物中預測通量較低的代謝途徑也具有較高比例的表達下調(diào)的酶?？傮w而言，當將FBA分析的通量預測與蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)進行比較時，我們檢測到根據(jù)條件44-64%的編碼通量變化>10%的反應的酶也有差異表達。

總體而言，這些酵母代謝變化中約有一半可以通過酶豐度變化來解釋，該結果表明通量的預測變化與蛋白質(zhì)組的測量變化之間的一致性。隨后我們直接比較了營養(yǎng)缺陷型存在情況下（即在SeMeCos環(huán)境中）與從全基因組原養(yǎng)型菌落（即WT群落）中分離出來的原養(yǎng)型的蛋白質(zhì)組（圖3d）。我們發(fā)現(xiàn)，與生長在原養(yǎng)型細胞之間的原養(yǎng)型細胞相比，在營養(yǎng)缺陷型存在條件下生長的原養(yǎng)型細胞中的酶表達（特別是涉及氨基酸生物合成途徑的酶）顯著不同（圖3d）。值得注意的是，雖然在公共原養(yǎng)型細胞中更多的途徑上調(diào)，但其他途徑被下調(diào)，這表明原養(yǎng)型細胞貢獻并消耗了SeMeCos中的代謝物。我們還觀察到核糖體和其他生長調(diào)節(jié)蛋白的較高表達。這也與上述觀察結果一致，即在沒有抗真菌藥物存在的情況下，原養(yǎng)型生物盡管承擔了H、L、U和M的合成，但與SeMeCos相比保持較快的生長速度。

圖3 原養(yǎng)型蛋白質(zhì)組對營養(yǎng)缺陷型存在的反應。

a，營養(yǎng)缺陷型SeMeCos菌株中原養(yǎng)型基因組恢復及用CFP標記所示質(zhì)粒的示意圖。根據(jù)CFP表達對原養(yǎng)型和營養(yǎng)缺陷型種群進行分類。b，SeMeCos中分選的營養(yǎng)缺陷型與原營養(yǎng)型細胞的蛋白質(zhì)組學分析；差異表達蛋白(DEP)如火山圖所示。c，左上：SeMeCos中營養(yǎng)缺陷型相對于共生原養(yǎng)型的蛋白質(zhì)組學分析。右上：參與氨基酸生物合成的差異表達蛋白質(zhì)和代謝酶的總結。僅在b中顯著差異表達的蛋白質(zhì)之間進行比較，其中P < 0.05。底部：SeMeCos中相對于原養(yǎng)型營養(yǎng)缺陷型代謝酶的差異表達（log2FC），使用iPATH3映射到酵母代謝網(wǎng)絡；n=4。d，左上：相對于自身生長的原養(yǎng)型細胞，從SeMeCos分離的原養(yǎng)型細胞的蛋白質(zhì)組學分析。右上：氨基酸生物合成中差異表達蛋白質(zhì)和代謝酶的總結。僅對在b中顯著差異表達的蛋白質(zhì)進行比較，其中P < 0.05。底部：與營養(yǎng)缺陷型細胞共生長(在SeMeCos中)的原養(yǎng)型細胞中酶的差異蛋白表達(log2FC)和原養(yǎng)型細胞（相對于在WT群落中自身生長的原養(yǎng)型細胞）的差異代謝酶表達，利用iPATH3映射到酵母代謝網(wǎng)絡中；n=4。當P?< 0.05時，蛋白質(zhì)被認為是DEP。log FC<0或>0，分別為下調(diào)或上調(diào)。Abs，絕對值。    

6.高代謝物外排使營養(yǎng)缺陷型具有唑類耐受性    

細胞外代謝物的濃度取決于跨膜轉運。在酵母菌中，氨基酸的輸出在很大程度上是由具有廣譜底物的代謝物轉運蛋白驅動的，這些轉運蛋白還負責藥物和外源性物質(zhì)的輸出，包括唑類抗真菌藥。事實上，引起抗真菌物質(zhì)耐受性和抗性的機制是增加藥物外排。如果更高的外排活性影響藥物濃度，我們推測從營養(yǎng)缺陷型向群落空間氨基酸輸出的增加（圖2c)可能解釋了對抗真菌物質(zhì)的更高耐受性。我們首先探索了一個先前用于量化營養(yǎng)缺陷型對基因表達異位顯性影響的轉錄組數(shù)據(jù)集。我們發(fā)現(xiàn)，與原養(yǎng)型相比，具有相關抗真菌活性（PDR5和SNQ2）的三個質(zhì)膜ATP結合盒（ABC）轉運蛋白中的兩個在許多營養(yǎng)缺陷型中的表達水平更高。為了量化輸出活性，我們隨后將DiOC5(3)（一種用于監(jiān)測一般輸出活性的陽離子羰花青染料）應用于SeMeCos。DiOC5(3)被動擴散到細胞中，其輸出依賴于ABC/MFS轉運蛋白活性。因此，輸出活性較高細胞DiOC5(3)的染色減少。我們使用與三種編碼相同遠紅外TagRFP657蛋白的質(zhì)?；パa的具有三種營養(yǎng)缺陷型（his3Δ、leu2Δ和met15Δ）的SeMeCos菌株，并通過流式細胞術評估了DiOC5(3)的熒光強度。在這種情況下，平均而言，營養(yǎng)缺陷與熒光強度成反比，熒光強度與每個細胞攜帶的質(zhì)粒數(shù)量有關（圖4a）。該實驗使我們能夠定量評估具有多個營養(yǎng)缺陷型的復雜SeMeCos系統(tǒng)中營養(yǎng)缺陷和染料攝取之間的關系。    

熒光標記和DiOC5(3)熒光水平呈正相關，表明原養(yǎng)型亞群較營養(yǎng)缺陷型亞群輸出染料的速度更慢（Spearman秩系數(shù)=2.2×10–16，R=0.53）（圖4a)。為證明確實是營養(yǎng)缺陷型輸出染料更快，我們使用了單一的營養(yǎng)缺陷型、表達eCFP的SeMeCos菌株，用DiOC5(3)進行染色并通過熒光顯微鏡分析染料強度。這些分析還揭示了與原養(yǎng)型相比，營養(yǎng)缺陷型種群的平均相對熒光強度更低（圖4b）。因此營養(yǎng)缺陷型維持較低的DiOC5(3)濃度，這表明與原養(yǎng)型相比其具有更大的輸出活性。與此同時，我們試圖確定藥物對細胞大小的影響，在考慮改變藥物抗性和/或轉運的潛在機制時需要考慮到這一點。對SeMeCos藥物篩選數(shù)據(jù)的重新分析表明，盡管某些藥物會影響細胞大小，但大多數(shù)經(jīng)測試的唑類藥物并非如此。    

接下來，我們建立了一種LC-MS方法來量化唑類處理的SeMeCos分選的CFP–營養(yǎng)缺陷型和CFP+原養(yǎng)型中的烯效唑細胞內(nèi)濃度。從四個群落中分類的營養(yǎng)缺陷型亞群的烯效唑細胞內(nèi)濃度相對于原養(yǎng)型顯著降低（圖4c）。在每種情況下，營養(yǎng)缺陷型的唑類水平都低于相應的原養(yǎng)型。我們進一步注意到URA3和MET15營養(yǎng)缺陷型中唑類的絕對值較低，其次是HIS3和LEU2，分別對應于它們在藥物耐受性方面的差異（圖4c）。采用未經(jīng)藥物處理的培養(yǎng)基，我們將亞群分選并接種到只有原養(yǎng)型可以生長的基本(SM)培養(yǎng)基或支持兩者生長的相應補充培養(yǎng)基(+H/L/U/M)上，并使用DDAs評估了對咪康唑或烯效唑的藥物耐受性（圖4d）。事實上，當從SeMeCos中分選出來時，含有較低濃度烯效唑的ura3Δ和met15Δ細胞在唑類存在條件下確實生長地更好，當從同一群落中分離時保持更高唑類濃度的his3Δ、leu2Δ細胞也是如此（圖4e)。在咪康唑處理的細胞中也觀察到類似的結果：實際上，his3Δ和leu2Δ營養(yǎng)缺陷型的恢復力要強得多，突出了不同唑類效力對藥物耐受性的影響。

圖4 營養(yǎng)缺陷型細胞中代謝物輸出活性的增加促進了藥物耐受性。

a，SeMeCos培養(yǎng)物與DiOC5(3)孵育，并用流式細胞術評估所述熒光種群。通過TagRFP657熒光對SeMeCos中的原養(yǎng)型、單營養(yǎng)缺陷型和雙營養(yǎng)缺陷型（紅色梯度）和三營養(yǎng)缺陷型（黃色）種群進行門控。通過mclust進行高斯曲線擬合和聚類分配，確定了具有不同營養(yǎng)缺陷水平的亞群。H、L和M分別表示組氨酸、亮氨酸和甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷型；PRO，原養(yǎng)型亞群。b，SeMeCos培養(yǎng)物與DiOC5(3)孵育，固定并通過熒光顯微鏡進行分析。通過熒光鑒定原養(yǎng)型和營養(yǎng)缺陷型，其中兩個種群對應于鑒定的低和高染料保留。C，通過LC-MS/MS測量從單一營養(yǎng)缺陷型SeMeCos中分選的營養(yǎng)缺陷型和原養(yǎng)型亞群中烯效唑的細胞內(nèi)濃度。使用雙側t檢驗確定統(tǒng)計顯著性，**** P < 0.00005。d，將來自分選的單一營養(yǎng)缺陷型SeMeCos的營養(yǎng)缺陷型和原養(yǎng)型亞群接種到具有互補氨基酸 (+H/L/U/M)的SM或補充有SM的培養(yǎng)基上，使滴定A:P比率成為可能。e，對暴露于烯效唑的四種分選SeMeCos菌株(SM或SM+H/L/U/M上)進行DDA檢測。    

討論

微生物細胞通常會產(chǎn)生、釋放、攝取和感知范圍廣泛的代謝物，當微生物共同生長時，這些內(nèi)在的代謝特性會導致高等級的代謝物交換。事實上，對于許多代謝物而言，原養(yǎng)型微生物優(yōu)先從外代謝組中攝取，而不是其自身的生物合成生長能力。越來越多的證據(jù)表明，群落細胞內(nèi)的代謝物交換程度是廣泛的，定量代謝組學數(shù)據(jù)顯示高水平的代謝物輸出豐富了單物種和多物種群落的外代謝組。微生物群落內(nèi)高度的代謝物可利用性反映在營養(yǎng)缺陷型細胞的高流行率上，這些細胞只有在群落環(huán)境中含有其生長必需的生長支持濃度的代謝物時才能生長。    

對于如此高頻的營養(yǎng)缺陷型如何在群落內(nèi)生存而不處于劣勢這一問題仍存在激烈爭論?！昂诨屎蠹僬f”是關于營養(yǎng)缺陷型成功的一種普遍解釋，該假設認為細胞要么通過減少代謝物合成負擔從而在營養(yǎng)缺陷中獲益，或者從細胞一旦輸出就無法將其資源私有化的情況中獲利。然而，圍繞著營養(yǎng)缺陷型成功的一個難題是“騙子困境”，因為營養(yǎng)缺陷型可以利用提供代謝物而不獲得任何好處的原養(yǎng)型。如果這種獲益允許營養(yǎng)缺陷型比原養(yǎng)型生長得更快，它最終將會破壞群落的穩(wěn)定。對在群落中觀察到的相對穩(wěn)定共存的另一種可能的解釋是原養(yǎng)型生物可能只是簡單地輸出或漏出“無成本”的代謝物。在這種情況下，即使是騙子的營養(yǎng)缺陷型細胞也可能給群落帶來最小成本，因為營養(yǎng)缺陷型生長所必需的代謝物被視為原養(yǎng)型產(chǎn)生的廢物。    

本研究的結果為理解營養(yǎng)缺陷型在微生物群落中的成功增加了新的理解。我們的研究結果表明，當從群落中獲得特定代謝物時，營養(yǎng)缺陷型廣泛地重新配置其代謝，溢出代謝物而不是吸收代謝物。因此，營養(yǎng)缺陷型的存在會增加群落環(huán)境中的代謝物濃度。我們進一步表明，細胞外環(huán)境的這種變化會對群落產(chǎn)生深遠影響，因為微生物細胞（無論是原養(yǎng)型還是營養(yǎng)缺陷型）都能感知細胞外代謝組的變化并相應地調(diào)整其代謝。我們發(fā)現(xiàn)了相互反應的證據(jù)，在這一反應中，原養(yǎng)型在營養(yǎng)缺陷型存在的情況下下調(diào)幾種代謝酶，表明它們利用了營養(yǎng)缺陷型釋放的代謝物。因此，包含營養(yǎng)缺陷型細胞的群落具有廣泛改變的代謝特性。    

營養(yǎng)缺陷型具有與原養(yǎng)型相同的基本代謝網(wǎng)絡結構，并且這種代謝網(wǎng)絡的相互聯(lián)系解釋了當細胞從自身合成氨基酸轉變?yōu)閿z取氨基酸時，大量不相關代謝物溢出的增加。事實上，我們發(fā)現(xiàn)在細胞外代謝物存在時，WT細胞會像營養(yǎng)缺陷型那樣吸收代謝物，而且在實驗中我們發(fā)現(xiàn)其代謝相應地發(fā)生改變。從這種情況中，我們得出結論：攝取代謝物以有效利用外代謝組的能力是微生物細胞的特性，因此不需要二次適應就可生效。事實上，作為自然群落成員的細胞會溢出大量代謝物，例如乳酸菌和酵母菌群落。在遺傳營養(yǎng)缺陷型中發(fā)現(xiàn)藥物耐受性增加，并在誘導代謝攝取的遺傳原養(yǎng)型細胞中得到復制，這證實了上述觀點。我們想強調(diào)的是，因為這些代謝特性，耐受性的增加可以解釋為單個細胞的代謝優(yōu)化且不需要營養(yǎng)缺陷型和原養(yǎng)型的共同進化是有益的。事實上，代謝物交換相互作用的基礎依賴于微生物的基本代謝特性，特別是其反饋抑制內(nèi)在生物合成途徑以有效攝取和利用細胞外代謝物的能力，而代謝網(wǎng)絡中的重新配置導致溢出代謝的改變。后一種變化可以通過代謝網(wǎng)絡的結構來解釋，這在很大程度上依賴于互換代謝物的熱力學和反應特性。由于高度的相互連接，當細胞從自身合成轉換為攝取代謝物時，代謝物流動會發(fā)生廣泛變化。    

最終，我們的研究結果揭示了一種將代謝相互作用與抗微生物藥物治療的穩(wěn)健性聯(lián)系起來的生化機制。通過分析作為EMP的一部分采集的數(shù)據(jù)以及大量的腸道微生物組數(shù)據(jù)，并經(jīng)起源于SeMeCo模型的證實，我們發(fā)現(xiàn)氨基酸營養(yǎng)缺陷型非常普遍，并且比原養(yǎng)型更能適應廣泛的藥物暴露。我們提供的證據(jù)表明潛在機制在于細胞從特定必需代謝物的自我合成轉變?yōu)閿z取時其代謝重組導致代謝物輸出活性增加。這提出了有吸引力的藥物療效先驗預測前景，盡管仍需進一步表征藥物外排泵的結構和活性特征。數(shù)據(jù)表明，增加的藥物耐受性是一種新興特性，是代謝物交換相互作用的結果，其中代謝物交換的程度較簡單地通過營養(yǎng)缺陷型的數(shù)量來確定更為復雜。我們的代謝組數(shù)據(jù)、FBA模型和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)表明，用于模擬營養(yǎng)缺陷型-原養(yǎng)型相互作用的每種不同代謝物（H、L、U和M）對廣泛的代謝物和蛋白質(zhì)組具有不同的影響，并且每種代謝物含量對藥物水平和耐藥性有不同的定量效應。因此，增加對藥物的穩(wěn)健性是細胞間代謝物交換活動的功能，該功能由營養(yǎng)缺陷型的存在刺激（根據(jù)它們與其他細胞相互作用的程度）。    

雖然我們在研究中沒有關注耐藥性進化這一方面，但在將代謝相互作用歸因于耐藥性出現(xiàn)的多個報道背景下，我們的發(fā)現(xiàn)也值得討論。代謝相互作用可以驅動對耐藥基因傳播至關重要的群落結構。此外，抗菌素耐藥性的演變可能源于其他抑制性藥物濃度下生長緩慢的耐受細胞亞群，耐藥基因可以通過水平基因轉移在復雜群落中迅速傳播。我們的數(shù)據(jù)表明，在營養(yǎng)缺陷型存在并刺激高度代謝相互作用的群落中，藥物治療后能夠持續(xù)存在的細胞的有效種群規(guī)模增加，可能加速了適應性進化。這一推測與最近的報道一致，該報道表明代謝進化分析后代謝突變數(shù)量增加導致細菌耐藥性增加。     

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