環(huán)境內(nèi)分泌干擾物影響魚類脂代謝的生物學(xué)機(jī)制探究及對(duì)魚類消費(fèi)人群的健康危害風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

【摘要】： 環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(EDCs)是一類存在于自然水環(huán)境中的具有類激素效應(yīng)的化學(xué)物質(zhì),可對(duì)生物體的免疫、內(nèi)分泌和神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生干擾效應(yīng)。由于水體中的EDCs直接暴露魚類,使得魚類比其他的陸生動(dòng)物遭受更加強(qiáng)烈的影響。EDCs可引發(fā)魚體的生殖退化,甚至造成性別逆轉(zhuǎn)。目前,已在部分地區(qū)的魚群中發(fā)現(xiàn)雄魚生殖特征雌性化的現(xiàn)象。除此之外,EDCs亦可干擾魚類的能量代謝。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中,魚類的代謝性疾病十分普遍,尤其體現(xiàn)在魚體的脂肪過度沉積,包括脂肪肝和腹腔脂肪嚴(yán)重沉積等。這不僅危害魚類自身的健康,降低魚類的抗應(yīng)激能力,同時(shí)還會(huì)降低水產(chǎn)品品質(zhì),增加食品安全風(fēng)險(xiǎn)。但是,EDCs是如何干擾魚類的脂代謝,以及EDCs對(duì)魚類的脂代謝影響是否亦存在性別差異,該方面尚無研究。并且,EDCs對(duì)人類亦可造成癌癥和畸形等不利的健康損傷。而人體攝入的EDCs大部分來自于對(duì)魚類的消費(fèi)和攝入。但是,當(dāng)前魚體的EDCs對(duì)消費(fèi)者人類造成的健康風(fēng)險(xiǎn)如何至今尚無詳細(xì)報(bào)道。因此,本論文旨在探究EDCs對(duì)魚類脂代謝的性別二態(tài)作用及其生物學(xué)分子機(jī)制,并評(píng)估EDCs通過魚類對(duì)消費(fèi)人群造成的健康風(fēng)險(xiǎn)。本工作采用脂質(zhì)組成分析、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、蛋白印跡、轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析、固相萃取、加壓液相萃取和組織學(xué)分析等技術(shù)手段,首先以斑馬魚(Danio rerio)作為的研究對(duì)象,探究?jī)煞N環(huán)境內(nèi)分泌干擾物雌二醇(E2)和雙酚A(BPA)對(duì)斑馬魚脂代謝所產(chǎn)生的性別二態(tài)性影響及其分子機(jī)制。隨后以養(yǎng)殖魚類-大黃魚(Pseudosciaena crocea)、羅非魚(Oreochromis niloticus)和黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)作為研究對(duì)象,通過對(duì)不同魚體EDCs的檢測(cè)和分析,評(píng)估其對(duì)魚類消費(fèi)人群的健康危害風(fēng)險(xiǎn),并追蹤EDCs進(jìn)入養(yǎng)殖魚體的主要傳遞載體和途徑。論文的主要結(jié)果和結(jié)論如下:1.環(huán)境內(nèi)分泌干擾物對(duì)魚類脂代謝的性別二態(tài)影響及其生物學(xué)機(jī)制在探究E2和BPA對(duì)魚類的脂代謝性別二態(tài)影響之前,首先要確定雌雄魚之間的脂代謝是否存在性別差異。采用脂肪含量為1%、7%和13%的飼料分別投喂雌雄斑馬魚6周,并對(duì)雌雄斑馬魚的脂質(zhì)組成和脂代謝調(diào)控進(jìn)行比較。結(jié)果表明,在同一種飼料處理下,雌魚的總脂肪和肝臟中的甘油三酯(TG)含量顯著高于雄魚。并且,雄魚的總脂肪和各組織中的TG含量,在不同的飼料處理組間比較穩(wěn)定。而雌魚的總脂肪和TG含量,在不同的飼料處理組中差異顯著,尤其體現(xiàn)在高脂飼料處理組中。肝臟轉(zhuǎn)錄組的結(jié)果顯示,雌雄斑馬魚的脂代謝通路差異明顯。雌魚肝臟中脂肪合成相關(guān)基因:乙酰輔酶A羧化酶(acc)、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(srebp-1c)和脂肪酸合成酶(fasn)表達(dá)量顯著高于雄魚。以上研究結(jié)果表明,雌雄魚之間的脂質(zhì)組成和脂代謝調(diào)控模式存在顯著差異。為了選取合適的E2和BPA暴露劑量,在正式實(shí)驗(yàn)開始之前,本研究先進(jìn)行暴露濃度的篩選實(shí)驗(yàn)?；谇捌诎l(fā)現(xiàn)雄魚的脂代謝較為穩(wěn)定,因此,選擇雄斑馬魚進(jìn)行E2和BPA的暴露濃度篩選實(shí)驗(yàn)。在正常脂肪含量飼料投喂下,采用不同梯度濃度的E2和BPA暴露雄斑馬魚6周。以E2(200 ng/L)和BPA(100μg/L)作為低濃度處理組,E2(2000 ng/L)和BPA(2000μg/L)作為高濃度處理組,探究不同濃度的E2和BPA對(duì)魚體脂代謝的影響。所有E2和BPA處理組均可顯著地提高斑馬魚的生長(zhǎng),破壞其精巢結(jié)構(gòu),抑制精子發(fā)育,并誘導(dǎo)雄魚的生殖系統(tǒng)發(fā)生雌性化的現(xiàn)象。同時(shí),與對(duì)照組和高濃度E2和BPA處理組相比,低濃度處理組可顯著改變魚體的脂質(zhì)組成和脂代謝模式,促進(jìn)魚體的總脂肪,以及肝臟中的TG和游離脂肪酸(FFA)發(fā)生積累。以上研究結(jié)果表明,E2和BPA對(duì)魚的脂代謝影響具有顯著的濃度依賴效應(yīng)。濃度篩選實(shí)驗(yàn)顯示,E2(200 ng/L)和BPA(100μg/L)暴露濃度對(duì)斑馬魚的脂代謝可產(chǎn)生顯著性影響。因此,為了深入探究E2和BPA對(duì)魚類脂代謝的性別二態(tài)影響及其生物學(xué)分子機(jī)制,選擇E2(200 ng/L)和BPA(100μg/L)分別暴露雌雄斑馬魚6周,同時(shí)增設(shè)雌激素受體抑制劑他莫昔芬(TAM)暴露組。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),E2和BPA主要通過提高雄魚體內(nèi)脂肪合成基因的表達(dá),進(jìn)而顯著地增加魚體的總脂肪和肝臟中的TG含量,使得雄魚的脂肪含量接近于雌魚。同時(shí),E2和BPA暴露后的雄魚的脂代謝調(diào)控模式,與對(duì)照組雄魚的脂代謝調(diào)控模式之間差異顯著,而與對(duì)照組雌魚的脂代謝調(diào)控模式相似度極高。這表明,E2和BPA暴露后雄魚的脂代謝調(diào)控出現(xiàn)雌性化的表征。脂代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)結(jié)果顯示,E2和BPA可抑制腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)蛋白活性,從而降低AMPK通路下游的脂肪分解相關(guān)基因的表達(dá)。同時(shí),被抑制的AMPK蛋白亦可激活雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和SREBP-1c通路,并進(jìn)一步啟動(dòng)脂肪合成基因fasn和acc的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。除此之外,E2和BPA亦可通過抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子3(STAT3)蛋白的表達(dá),促進(jìn)下游srebp-1c的基因轉(zhuǎn)錄。以上研究結(jié)果表明,E2和BPA主要通過抑制AMPK蛋白的表達(dá)激活mTOR/SREBP-1c的脂肪合成相關(guān)通路,提高雄魚的脂肪積累,最后導(dǎo)致雄魚的脂代謝調(diào)控模式趨于雌性。2.養(yǎng)殖魚體環(huán)境內(nèi)分泌干擾物對(duì)消費(fèi)人群的健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估由于人們?nèi)粘Ｉ钪械聂~類供應(yīng)主要來源于水產(chǎn)養(yǎng)殖,因此,本部分工作選擇養(yǎng)殖魚類開展魚體EDCs對(duì)人類健康的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。首先評(píng)估自然水環(huán)境中的E2和BPA,通過養(yǎng)殖魚大黃魚對(duì)人體的健康風(fēng)險(xiǎn)。我們使用等脂不等糖的配合飼料在我國(guó)象山海域養(yǎng)殖大黃魚8周,以此建立兩種體脂含量不同的養(yǎng)殖魚模型。通過檢測(cè)魚體的脂肪含量及E2和BPA的積累水平,探究不同能量含量的飼料對(duì)養(yǎng)殖魚的生長(zhǎng)和體內(nèi)污染物蓄積的影響,并評(píng)估實(shí)際養(yǎng)殖魚體BPA含量對(duì)人體的健康風(fēng)險(xiǎn)。結(jié)果顯示,高能飼料處理組中全魚、肌肉和肝臟中的脂肪含量顯著高于低能飼料處理組。兩個(gè)不同飼料處理組魚體的E2濃度沒有呈現(xiàn)顯著性差異,但BPA在高能飼料處理組魚體的濃度具有高于低能飼料處理組的趨勢(shì)。雖然本研究中,大黃魚體內(nèi)積累的BPA并不會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生健康危害。但高能飼料處理組魚體的BPA對(duì)人體產(chǎn)生的健康風(fēng)險(xiǎn),仍然具有高于低能飼料處理組的趨勢(shì),這表明飼料組成可影響環(huán)境污染物在養(yǎng)殖魚體內(nèi)的積累濃度,進(jìn)而影響其對(duì)人體造成的健康危害風(fēng)險(xiǎn)?；谏鲜龃簏S魚的研究結(jié)果,為了深入探究飼料成分對(duì)養(yǎng)殖魚體EDCs積累的影響,以及EDCs在不同種類養(yǎng)殖魚體的沉積差異,我們?cè)诒绢I(lǐng)域首次開展了EDCs“從海洋到餐桌”的全養(yǎng)殖鏈追蹤。本研究從我國(guó)渤海和黃海捕撈一批鳀魚,送至兩家粗制魚油加工廠制得粗制魚油,再將兩種粗制魚油送至精煉魚油加工廠制得精煉魚油。再以三種魚油作為飼料中主要的脂肪源,制得含有三種不同魚油的飼料,分別為粗制魚油1號(hào)飼料、粗制魚油2號(hào)飼料和精煉魚油飼料。使用三種飼料分別養(yǎng)殖羅非魚(lean fish,瘦魚)和黃顙魚(oily fish,油魚)8周,對(duì)魚的生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)指標(biāo),及肌肉中的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物DDTs、PCBs和二噁英進(jìn)行檢測(cè)分析。研究發(fā)現(xiàn),黃顙魚和羅非魚的生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)組成顯著不同,黃顙魚的脂肪含量顯著高于羅非魚,但其增重、飼料效率和蛋白含量顯著地低于羅非魚。并且,黃顙魚肌肉中的DDTs、PCBs和二噁英含量亦顯著高于羅非魚,同時(shí),黃顙魚體內(nèi)EDCs對(duì)人體產(chǎn)生的健康風(fēng)險(xiǎn)高于羅非魚。這說明養(yǎng)殖魚的種類可影響魚體EDCs的蓄積濃度,進(jìn)而影響其對(duì)人體造成的健康危害風(fēng)險(xiǎn)。通過分析養(yǎng)殖水體、飼料成分、魚油和養(yǎng)殖魚體的EDCs組成模式圖發(fā)現(xiàn),魚體的EDCs主要來自于飼料中的魚油成分,這表明魚油是海洋EDCs進(jìn)入養(yǎng)殖魚體的重要傳遞載體。并且,粗制魚油組魚體的EDCs含量顯著高于精煉魚油組魚體的EDCs含量,這說明魚油的加工技術(shù)亦可影響?zhàn)B殖魚體內(nèi)的EDCs積累濃度。上述研究結(jié)果表明,通過減少粗制魚油的使用,提高養(yǎng)殖魚的生長(zhǎng)和飼料效率,可有效地降低環(huán)境中EDCs對(duì)魚類消費(fèi)人群造成的健康危害風(fēng)險(xiǎn)。本研究論文立足于當(dāng)前我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖面臨的問題和挑戰(zhàn),以及魚類消費(fèi)人群的所可能面臨的健康隱患,較為全面而深入地闡明環(huán)境污染物對(duì)魚類代謝性疾病和人類健康的影響,為準(zhǔn)確評(píng)價(jià)當(dāng)前的環(huán)境健康與水產(chǎn)品品質(zhì)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。同時(shí),本研究首次追蹤海洋EDCs通過飼料魚油,傳遞至養(yǎng)殖魚體,最終進(jìn)入人體這一傳輸路徑。為保障水產(chǎn)品的綠色安全,并提高魚類消費(fèi)人群的身體健康素質(zhì)提供重要的參考依據(jù)。

【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019

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