：本發(fā)明屬于酶工程和食品工程，具體涉及一種乳糖酶酶分子的定向進(jìn)化、定點(diǎn)突變及其催化應(yīng)用。

背景技術(shù)

0、
背景技術(shù)：

1、低聚糖又稱寡糖類，是指單糖分子通過(guò)糖苷鍵連接的、聚合度為2-10的直鏈或支鏈碳水化合物，可簡(jiǎn)單分為功能性低聚糖和普通低聚糖兩大類。其中，功能性低聚糖(functional oligosaccharides)是指由2-10個(gè)相同或不同的單糖以糖苷鍵聚合而成，具有溫和的甜味和感官特性，可作為脂肪和糖的部分代替物用于食品中并改善食品質(zhì)地，但不被人體腸道酶消化，并到達(dá)大腸，作為生長(zhǎng)因子促進(jìn)雙歧桿菌、乳桿菌等有益菌增殖，增強(qiáng)礦物質(zhì)吸收，降低血脂、膽固醇和血糖指數(shù)，改善血壓，對(duì)人體健康產(chǎn)生有益的影響。

2、低聚半乳糖(galactooligosaccharides，gos)是一種天然存在人乳、牛乳、羊乳中的功能性低聚糖，是一種重要的益生元，對(duì)人類健康發(fā)揮了重要作用。上世紀(jì)50年代，已有報(bào)道利用β-半乳糖苷酶催化乳糖生產(chǎn)低聚半乳糖的工業(yè)化技術(shù)相關(guān)研究，國(guó)際上gos產(chǎn)品于1988年成功上市。低聚半乳糖的生產(chǎn)，主要以乳糖為原料，利用乳糖酶的轉(zhuǎn)糖基作用在乳糖水解過(guò)程中合成含一個(gè)葡萄糖或全部為半乳糖分子連接的低聚合度的寡糖，可表示為gal-(gal)n-glc/gal(n為1-4)。

3、乳糖酶(β-半乳糖苷酶的一種，ec 3.2.1.23)能夠通過(guò)其轉(zhuǎn)半乳糖基作用生成gos，是一種在乳品工業(yè)中非常具有商業(yè)價(jià)值的酶。用于生產(chǎn)gos的商品化乳糖酶一般來(lái)源于黑曲霉(a.niger)、米曲霉(a.oryzae)、乳酸克魯維酵母(kluyveromyces lactis)、脆壁克魯維酵母(k.fragilis)、羅倫特隱球菌(cryptococcus laurentii)和環(huán)狀芽胞桿菌(bacillus circulans)等菌株。不同來(lái)源的乳糖酶在酶活組成和轉(zhuǎn)苷活性上有一定差別，同時(shí)gos的生產(chǎn)工藝不同，但催化合成的低聚半乳糖主要以β-1,3、β-1,4、β-1,6糖苷鍵連接，其中以β-1,4糖苷鍵為主。此外，針對(duì)酶的耐高溫性能，研究開(kāi)發(fā)出一些新型的耐高溫乳糖酶。如嗜熱硫礦硫化葉菌(sulfolobussolfataricus)、直桿糖多孢菌(saccharopolyspora rectivirgula)、激烈火球菌(pyrococcusfuriosus)和海棲熱袍菌(thermotoga maritima)等微生物來(lái)源的乳糖酶，可以在70℃-80℃高溫下催化合成gos?，F(xiàn)有商品化乳糖酶，一般可以乳糖為原料形成5％-50％的低聚半乳糖。環(huán)狀芽胞桿菌atcc31382生產(chǎn)出的乳糖酶(如)，是目前為止合成gos能力最強(qiáng)的乳糖酶，這個(gè)酶在酶制劑產(chǎn)品中有4中不同的存在形式(song j,abe k,imanaka h,imamura k,minoda m,yamaguchi s,and nakanishi k,biosci.biotechnol.biochem.,2011；75,268-278)，其中，β-gal-c和β-gal-d被認(rèn)為是最有價(jià)值用于gos的生產(chǎn)。從環(huán)狀芽胞桿菌b2301中鑒定出的乳糖酶，具有在60℃以上的高溫條件下催化乳糖形成54.5％的gos，是目前所有報(bào)道的乳糖酶中g(shù)os合成性能最好的乳糖酶(趙繼華等，食品與發(fā)酵工業(yè)，2020)；高產(chǎn)乳糖酶的重組菌株-地衣芽胞桿菌bcbtbc168d發(fā)酵制備乳糖酶bcbg168-d的表達(dá)水平顯著提高(中國(guó)發(fā)明專利，zl202011051056.1)，實(shí)現(xiàn)了低聚半乳糖生產(chǎn)專用酶的高效制備。

4、在應(yīng)用于工業(yè)化制備低聚半乳糖的過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀芽胞桿菌乳糖酶催化乳糖中的半乳糖基轉(zhuǎn)糖基體系中，反應(yīng)終了仍然會(huì)出現(xiàn)高比例的底物乳糖的殘留，通常殘留在25％-30％，明顯增大了低聚半乳糖特別是高純度低聚半乳糖的制備成本。此外，進(jìn)一步提高其催化活性，也將會(huì)明顯降低其應(yīng)用過(guò)程的用酶成本并有可能進(jìn)一步降低低聚半乳糖的制造成本。因此本技術(shù)通過(guò)對(duì)乳糖酶的3d結(jié)構(gòu)分析和底物/產(chǎn)物分子對(duì)接，獲得乳糖酶分子中有可能提高酶活的可能突變位點(diǎn)，再通過(guò)定點(diǎn)突變并進(jìn)行異源表達(dá)制備突變體，檢測(cè)其酶活及其催化產(chǎn)物形成特征，獲得了一種催化活力顯著提升的高活性乳糖酶，可應(yīng)用于高效催化乳糖為低聚半乳糖，并有利于降低乳糖酶的制備成本。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

0、
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

1、本發(fā)明的目的是通過(guò)定向分子進(jìn)化獲得相應(yīng)的乳糖酶突變體，提高其催化乳糖合成低聚半乳糖的活性并顯著降低反應(yīng)體系中底物乳糖的剩余量，由此可顯著改善乳糖酶的應(yīng)用性能并擴(kuò)展其應(yīng)用領(lǐng)域，提升乳糖酶工業(yè)規(guī)模下制造效率。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明以乳糖酶bcbg168-d編碼基因(序列表seq id no.1所示核苷酸序列)或其氨基酸序列(序列表seq id no.2所示)為基礎(chǔ)，分析可能發(fā)生突變的氨基酸殘基(其中所描述的乳糖酶突變位點(diǎn)選擇是根據(jù)原始乳糖酶分子bcbg168-d(序列表seq id no.2)與葡萄糖分子對(duì)接并分析結(jié)果獲得)，通過(guò)定點(diǎn)突變制備突變體，通過(guò)突變體的表達(dá)與定向篩選，獲得性能優(yōu)良的乳糖酶突變體，分析評(píng)價(jià)其酶促應(yīng)用性能，并評(píng)價(jià)其在低聚半乳糖制備中的應(yīng)用價(jià)值。

3、本發(fā)明提供的技術(shù)方案之一，是一種乳糖酶突變體，所述乳糖酶突變體是在seqid no.2所示原始乳糖酶的基礎(chǔ)上發(fā)生氨基酸序列中的氨基酸殘基t446單點(diǎn)突變獲得的；

4、進(jìn)一步，所述乳糖酶突變體是在seq id no.2所示的氨基酸殘基t446上的突變，可以是被其余19種氨基酸殘基任意替換，即：蘇氨酸殘基可以用丙氨酸(ala，a)【此突變記為：t446→t446a，以此類推】、精氨酸(arg，r)、天冬氨酸(asp，d)、半胱氨酸(cys，c)、谷氨酰胺(gln，q)、谷氨酸(glu，e)、組氨酸(his，h)、異亮氨酸(ile，i)、甘氨酸(gly，g)、天冬酰胺(asn，n)、亮氨酸(leu，l)、賴氨酸(lys，k)、蛋氨酸(met，m)、苯丙氨酸(phe，f)、脯氨酸(pro，p)、絲氨酸(ser，s)、色氨酸(trp，w)、酪氨酸(tyr，y)或纈氨酸(val，v)替換；

5、優(yōu)選地，所述乳糖酶突變體是在seq id no.2所示原始乳糖酶的基礎(chǔ)上發(fā)生t446v、t446f、t446k、t446m、t446n、t446c、t446w突變中的任意一種獲得的；

6、更優(yōu)選地，所述乳糖酶突變體是在seq id no.2所示原始乳糖酶的基礎(chǔ)上發(fā)生t446v或t446n獲得的；

7、進(jìn)一步地，所述乳糖酶突變體為氨基酸序列如seq id no.4所示的t446v。

8、本發(fā)明提供的技術(shù)方案之二，是上述乳糖酶突變體的編碼基因。

9、本發(fā)明提供的技術(shù)方案之三，是包含上述編碼基因的重組載體或重組菌株；

10、進(jìn)一步地，所述重組載體采用的表達(dá)載體為phy-wzx質(zhì)粒；

11、進(jìn)一步地，所述重組菌株采用的宿主為地衣芽胞桿菌bcbt0529(已公布在中國(guó)發(fā)明專利zl202011051056.1中)；

12、更進(jìn)一步地，所述重組菌株是將所述乳糖酶突變體編碼基因克隆入表達(dá)載體phy-wzx，在地衣芽胞桿菌bcbt0529宿主細(xì)胞中進(jìn)行重組表達(dá)獲得。

13、本發(fā)明提供的技術(shù)方案之四，是上述重組載體或重組菌株的應(yīng)用，特別是在生產(chǎn)技術(shù)方案一所述乳糖酶突變體中的應(yīng)用。

14、本發(fā)明提供的技術(shù)方案之五，是技術(shù)方案一所述乳糖酶突變體的應(yīng)用，特別是在生產(chǎn)低聚半乳糖中的應(yīng)用。

15、有益效果：

16、本發(fā)明中的乳糖酶突變體，為通過(guò)定向分子進(jìn)化獲得的、具有催化乳糖生成低聚半乳糖的高活性乳糖酶突變體，其中t446v突變體比酶活提高71.1％，并且反應(yīng)體系中，底物乳糖的殘余量顯著降低，減低了5.54％。本發(fā)明乳糖酶新分子具有更好的應(yīng)用于低聚半乳糖制備的效率、提高產(chǎn)品質(zhì)量并同步降低生產(chǎn)成本，連帶有助于提高新表達(dá)菌種的產(chǎn)酶水平和進(jìn)一步降低乳糖酶發(fā)酵制備的成本。

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網(wǎng)址: 一種高活性乳糖酶突變體及其應(yīng)用 http://www.gysdgmq.cn/newsview780428.html