摘要：氨基酸發(fā)酵是我國發(fā)酵工業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)，近年來，隨著代謝工程的快速發(fā)展，氨基酸的代謝工程育種蓬勃發(fā)展。傳統(tǒng)的正向代謝工程、基于組學分析與計算機模擬的反向代謝工程以及借鑒自然進化的進化代謝工程，都有越來越多的應用。在氨基酸的工業(yè)生產(chǎn)中涌現(xiàn)出了一系列具有高效生產(chǎn)、抗逆性強等優(yōu)良性狀的菌株。日益劇烈的市場競爭對菌株的選育提出了新的要求，如開發(fā)高附加值氨基酸品種、菌株代謝的動態(tài)調(diào)控、適應新工藝的要求等。文中介紹了氨基酸生產(chǎn)相關的代謝工程研究進展以及未來的發(fā)展趨勢。

Advances and prospects in metabolic engineering for the production of amino acids

Qian Ma *, Li Xia *, Miao Tan , Quanwei Sun , Mengya Yang , Ying Zhang , Ning Chen     

Abstract: Fermentative production of amino acids is one of the pillars of the fermentation industry in China. Recently, with the fast development of metabolic engineering and synthetic biology technologies, the metabolic engineering for production of amino acids has been flourishing. Conventional forward metabolic engineering, reversed metabolic engineering based on omics data and in silico simulation, and evolutionary metabolic engineering mimicking the natural evolution, have shown increasingly promising applications. A series of highly efficient and robust amino acids-producing strains have been developed and applied in the industrial production of amino acids. The increasingly fierce market competition has put forward new requirements for strain breeding and selection, such as developing high value-added amino acids, dynamic regulation of cellular metabolism, and adapting to the requirements of new process. This review summarizes the advances and prospects in metabolic engineering for the production of amino acids.

Keywords: amino acids    metabolic engineering    Escherichia coli    Corynebacterium glutamicum    biosensor    

民以食為天，這是亙古不變的自然法則。在追求美好生活的新時代，人們對于營養(yǎng)與健康的需求日趨高漲。氨基酸作為重要的營養(yǎng)與功能元素，與我們的生活息息相關，其應用領域涉及食品、醫(yī)藥、飼料、化妝品等多種行業(yè)。目前，氨基酸發(fā)酵已成為我國發(fā)酵工業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)。據(jù)中國生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)協(xié)會統(tǒng)計，2019年，我國氨基酸發(fā)酵產(chǎn)品總產(chǎn)量約為609萬t，其中，L-谷氨酸286.6萬t，L-賴氨酸253.3萬t，L-蘇氨酸60.6萬t，L-色氨酸1.7萬t，其他氨基酸6.9萬t。與大宗氨基酸品種L-谷氨酸、L-賴氨酸、L-蘇氨酸相比，小品種氨基酸、高附加值氨基酸(L-組氨酸、L-絲氨酸、L-酪氨酸等) 的產(chǎn)量仍然較低，具有廣闊的市場提升前景。隨著代謝工程育種技術(shù)的快速發(fā)展，氨基酸優(yōu)良生產(chǎn)菌株的選育發(fā)展也越來越迅猛，為大宗氨基酸的低成本高效生產(chǎn)、高附加值小品種氨基酸的市場開拓提供了有力保障。本文將對代謝工程在氨基酸生產(chǎn)菌株選育方面的研究與應用進展進行綜述，并對氨基酸代謝工程育種的一些新的發(fā)展趨勢進行介紹。

1 代謝工程育種

1956年，日本協(xié)和發(fā)酵公司木下祝郎博士選育出了可以積累L-谷氨酸的谷氨酸棒桿菌Corynebacterium glutamicum，隨后，L-谷氨酸工業(yè)發(fā)酵的成功推動了其他氨基酸的發(fā)酵研究與生產(chǎn)，自此氨基酸的工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)正式拉開帷幕。傳統(tǒng)的氨基酸生產(chǎn)菌株主要基于代謝控制發(fā)酵原理，通過誘變篩選獲得。誘變菌株在氨基酸工業(yè)發(fā)酵中發(fā)揮了非常重要的作用，極大地推動了氨基酸發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展。然而，誘變菌株在工業(yè)發(fā)酵過程中容易存在營養(yǎng)缺陷、發(fā)酵不穩(wěn)定、產(chǎn)能難以繼續(xù)提升等問題。近年來，代謝工程育種在氨基酸生產(chǎn)菌株選育中的應用越來越多，成為誘變育種的有力補充。C. glutamicum、大腸桿菌Escherichia coli等模式微生物成為氨基酸生產(chǎn)代謝工程改造的主要宿主，一系列小品種、高附加值氨基酸產(chǎn)品及其衍生物生產(chǎn)菌株得到開發(fā)。

1.1 基于理性設計的正向代謝工程

基于一定的理性設計原則，從宿主菌株出發(fā)，進行目標合成途徑構(gòu)建與強化[1]、前體物供應強化[2]、旁路代謝阻斷與弱化[3]、輔因子平衡優(yōu)化[4-6]、目標產(chǎn)物輸出系統(tǒng)強化[7]等，以實現(xiàn)目標產(chǎn)物的高效生產(chǎn)，這是一種自上而下的正向代謝工程策略。

氨基酸作為初級代謝產(chǎn)物，在微生物中的合成通常存在復雜的調(diào)控系統(tǒng)，包括反饋調(diào)節(jié)、弱化調(diào)節(jié)等。如分支鏈氨基酸合成途徑中的關鍵酶乙酰羥酸合酶容易受到產(chǎn)物L-纈氨酸的反饋抑制[8]，色氨酸操縱子存在受L-色氨酸調(diào)節(jié)的弱化子結(jié)構(gòu)[9]。因而，在氨基酸生產(chǎn)菌株的正向代謝工程中，解除關鍵酶受到的反饋調(diào)節(jié)作用對于強化目標氨基酸的合成通常有較為明顯的作用[10]。除了關鍵酶的強化，目標氨基酸合成途徑上的非限速酶通常也需要調(diào)整其表達強度，通過啟動子優(yōu)化、核糖體結(jié)合位點優(yōu)化，以及合成途徑上多基因表達強度的組合優(yōu)化等，進行最佳生產(chǎn)強度合成途徑的構(gòu)建與強化。

如圖 1所示，多數(shù)氨基酸的合成需要以中心碳代謝過程的中間代謝產(chǎn)物為前體物[11]，如L-谷氨酸、L-谷氨酰胺等以三羧酸(TCA) 循環(huán)的α-酮戊二酸為前體物；L-纈氨酸、L-亮氨酸以糖酵解過程的產(chǎn)物丙酮酸為前體物；天冬氨酸族氨基酸以三羧酸循環(huán)的草酰乙酸為前體物；芳香族氨基酸需要以糖酵解中的磷酸烯醇式丙酮酸(PEP) 與磷酸戊糖途徑的赤蘚糖-4-磷酸(E4P) 為前體物。因此，在進行前體物供應強化時，需要對目標氨基酸合成途徑與中心碳代謝進行平衡重構(gòu)，使代謝流盡可能多地流向目標氨基酸合成，以實現(xiàn)在對細胞生長不構(gòu)成嚴重損害的條件下，盡可能地提高目標氨基酸的合成效率。近些年來，動態(tài)調(diào)控、精確調(diào)控成為代謝工程領域研究的重要方向，這也是代謝工程改造更加精細化的一種表現(xiàn)。

圖 1 氨基酸合成途徑[11]Fig. 1 Biosynthesis pathway of amino acids[11].

輔因子在細胞代謝的諸多過程都發(fā)揮重要作用，許多氨基酸的合成途徑也依賴特定的輔因子，如L-谷氨酸、L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-纈氨酸等的合成需要依賴NADPH；L-組氨酸、L-絲氨酸等的合成需要依賴NAD+。輔因子的供應與平衡對于目標氨基酸的合成效率也起著至關重要的作用，輔因子的供應平衡也是氨基酸代謝工程改造中的重要方面。近年來，研究者嘗試通過改變氨基酸合成路徑上相關酶的輔酶依賴性，實現(xiàn)發(fā)酵工藝的改變。Hasegawa等[4]通過對C. glutamicum中相關酶的輔酶依賴性由NADPH改變?yōu)镹ADH，實現(xiàn)了在無氧條件下進行L-纈氨酸的生產(chǎn)，生產(chǎn)強度與轉(zhuǎn)化率都有明顯的提升。此外，調(diào)控輔因子的合成，以及調(diào)控輔因子不同形態(tài)之間的轉(zhuǎn)變[12]，也是輔因子平衡調(diào)控的重要方式。

目前，基于理性設計的正向代謝工程仍然是氨基酸代謝工程育種的主要方式，通過組合運用不同的代謝工程策略，通?？梢垣@得菌株發(fā)酵水平的提升。但由于微生物系統(tǒng)的復雜性，有時理性設計并不總能產(chǎn)生預期的效果，基于組學分析與計算機模擬的反向代謝工程，以及借鑒自然進化的進化代謝工程可作為正向代謝工程的有力補充。

1.2 基于組學分析與計算機模擬的代謝工程

在傳統(tǒng)的氨基酸工業(yè)中，很多生產(chǎn)菌株是通過誘變育種的方式獲得的，與出發(fā)菌株相比，誘變菌株往往在基因、mRNA、蛋白質(zhì)、代謝物等水平存在差異，而這些差異很可能是菌株高產(chǎn)的原因?；诓煌?如誘變菌株與出發(fā)菌株) 的表型差異，利用組學技術(shù)反向解析導致表型差異的代謝水平、蛋白水平、mRNA水平、DNA水平差異，以獲得影響目標性狀的關鍵基因位點，作為代謝工程改造的潛在靶點[13-14]。隨著生物信息學與計算機模擬技術(shù)的不斷發(fā)展，基于組學分析獲得的潛在改造靶點，可先利用計算機模擬進行代謝預測[15]，再進行實驗室代謝工程改造，這樣可以使后續(xù)的代謝工程更加具有方向性、更加高效。

1.3 進化代謝工程

進化是大自然豐厚的饋贈，適者生存是高效的篩選法則。于是，人們嘗試在實驗室中模擬自然進化，并進行進化加速，以高效獲得理想的生物表型。進化在代謝工程中的應用，形成了進化代謝工程，涉及酶的定向進化、代謝進化、適應性進化等內(nèi)容[16]。通過代謝工程構(gòu)建，將目標基因型的篩選與容易識別的表型(如生長偶聯(lián)[17]、抗性偶聯(lián)[17]等) 或易于識別的信號(如熒光信號[18]等) 相關聯(lián)，實現(xiàn)了理性與隨機策略的結(jié)合，可通過高通量篩選，以提高篩選效率。近年來，進化代謝工程育種在氨基酸生產(chǎn)中的應用越來越多。Long等[17]將鳥氨酸環(huán)化脫氨酶的定向進化與抗生素抗性基因表達偶聯(lián)起來，通過在抗性培養(yǎng)基中篩選生長快速的菌株，獲得了高效催化鳥氨酸合成L-脯氨酸的鳥氨酸環(huán)化脫氨酶，并最終在L-精氨酸生產(chǎn)菌鈍齒棒桿菌Corynebacterium crenatum中實現(xiàn)了38.4 g/L的L-脯氨酸產(chǎn)量。隨著生物傳感技術(shù)的迅速發(fā)展，其在進化代謝工程中的應用越來越廣泛[19]。在氨基酸的進化代謝工程研究方面，生物傳感器的主要應用如表 1所示。構(gòu)建響應目標氨基酸濃度的生物傳感器，可將胞內(nèi)目標氨基酸濃度與熒光信號強度相偶聯(lián)，通過篩選高強度的熒光信號，獲得高產(chǎn)目標氨基酸的菌株。目前，基于轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Lrp響應分支鏈氨基酸/甲硫氨酸濃度[20]、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子LysG響應L-賴氨酸濃度產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用構(gòu)建的生物傳感器已在相應氨基酸的生產(chǎn)菌選育中應用。除基于轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子構(gòu)建的生物傳感器之外，基于RNA調(diào)控的核糖開關也是構(gòu)建生物傳感器的重要基礎，目前已發(fā)現(xiàn)的響應氨基酸的核糖開關有L-賴氨酸核糖開關[21]與甘氨酸核糖開關[22]。隨著新型生物傳感器的研發(fā)，進化代謝工程在氨基酸育種中將會發(fā)揮越來越重要的作用。

表 1 生物傳感器在氨基酸代謝工程中的應用Table 1 Application of biosensors in metabolic engineering for production of amino acids

Amino acid Type of biosensor Output Host Reference L-valine Transcriptional regulation based on Lrp eYFP C. glutamicum [18] L-tyrosine Transcriptional regulation based on TyrR mCherry E. coli [23] L-lysine Transcriptional regulation based on LysG eYFP C. glutamicum [24] L-lysine Riboswitch based on lysC tetA-sGFP E. coli [25] L-tryptophan Synthetic riboswitch tetA-sGFP E. coli [25] L-phenylalanine Transcriptional regulation based on screening of mtr promotor Venus E. coli [26]

2 大宗氨基酸代謝工程育種2.1 L-谷氨酸的代謝工程育種

L-谷氨酸作為最大宗的氨基酸品種，具有成熟的發(fā)酵生產(chǎn)工藝。目前，L-谷氨酸的工業(yè)生產(chǎn)主要采用C. glutamicum生物素亞適量控制工藝與溫度敏感突變株發(fā)酵工藝，應用的菌株大多通過誘變篩選獲得，發(fā)酵產(chǎn)量最高可達220 g/L以上。L-谷氨酸的高效生產(chǎn)與細胞內(nèi)代謝狀態(tài)變化、細胞的高效分泌過程密切相關，多種處理方式都可以促進C. glutamicum高效分泌L-谷氨酸，如生物素亞適量控制、表面活性劑添加、青霉素添加、溫度提升等。但對于C. glutamicum中L-谷氨酸快速分泌的機制仍然未有清晰闡釋，這也限制了L-谷氨酸代謝工程育種的應用。目前人們多利用組學分析手段比較誘變菌株與出發(fā)菌株的基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組等差異，探索影響L-谷氨酸快速合成與分泌的關鍵所在。Shi等[27]通過對溫度敏感的C. glutamicum TCCC 11822與野生型菌株ATCC 13032進行基因組比較，發(fā)現(xiàn)TCCC 11822中存在細胞膜合成基因的突變以及細胞壁合成基因murAB的缺失。在野生型菌株C. glutamicum ATCC 13032中敲除murAB基因[27]，或引入相應突變基因[28]，可以激發(fā)C. glutamicum ATCC 13032中L-谷氨酸的溫度敏感分泌。

隨著基因組編輯技術(shù)的快速發(fā)展，其在C. glutamicum中的應用研究也陸續(xù)開展，Krumbach等[29]利用CRISPR/Cas12a技術(shù)對C. glutamicum基因組上表達L-谷氨酸輸出機械通道蛋白MscCG的基因進行了密碼子飽和突變，最終篩選到一系列可以促進L-谷氨酸輸出的MscCG突變體。Cleto等[30]嘗試在C. glutamicum中利用CRISPRi技術(shù)對磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶編碼基因pck與丙酮酸激酶編碼基因pyk進行轉(zhuǎn)錄干擾，并探索其對L-谷氨酸生產(chǎn)的影響；結(jié)果表明，相比于pck與pyk的直接敲除，轉(zhuǎn)錄干擾可更加有效地提升L-谷氨酸的產(chǎn)量。未來隨著CRISPRi技術(shù)在C. glutamicum中的成熟應用，可更方便地進行代謝過程的精確調(diào)控與動態(tài)調(diào)控。

2.2 L-賴氨酸的代謝工程育種

L-賴氨酸是飼料中最常用的氨基酸添加劑，具有促進動物生長發(fā)育、提高肉質(zhì)品品質(zhì)等重要功能，市場需求非常廣泛。近年來，L-賴氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)水平不斷提升，實現(xiàn)了在C. glutamicum、E. coli中的高效生產(chǎn)，最高發(fā)酵產(chǎn)量可達240 g/L[31]，轉(zhuǎn)化率在68%以上。

傳統(tǒng)的L-賴氨酸生產(chǎn)菌是通過誘變篩選獲得，基于組學分析與計算機模擬的反向代謝工程在L-賴氨酸的生產(chǎn)中也發(fā)揮了重要的作用。Ohnishi等[13]通過對誘變菌株C. glutamicum B-6與其原始菌株進行比較基因組學分析，確定了L-賴氨酸高產(chǎn)菌中存在3個突變基因?qū)-賴氨酸的高產(chǎn)有重要作用，于是將lysCT311I、homV59A、pycP458S這3個突變基因引入野生型菌株中，達到了80 g/L的L-賴氨酸產(chǎn)量。Ikeda等[32]后來同樣基于C. glutamicum B-6與其原始菌株的比較基因組學分析，確定了L-賴氨酸末端合成、中心碳代謝中的5個突變基因?qū)τ贚-賴氨酸的高產(chǎn)有重要作用，在野生型菌株中引入這些突變基因，構(gòu)建的工程菌株不僅獲得了L-賴氨酸高產(chǎn)量與高轉(zhuǎn)化率，同時具有良好的發(fā)酵穩(wěn)定性與耐熱性。除組學分析之外，代謝模擬也是反向代謝工程改造的有效手段。Ye等[33]基于E. coli代謝模型iML1515，構(gòu)建了酶約束模型ec_iML1515，并基于此模型對20個高需求蛋白的表達水平進行了優(yōu)化，使L-賴氨酸產(chǎn)量達到95.7 g/L，進一步優(yōu)化NH4+及溶氧水平使L-賴氨酸產(chǎn)量達到193.6 g/L，葡萄糖轉(zhuǎn)化率高達0.74 g/g，展現(xiàn)了代謝模擬在指導代謝工程改造方面的強大功能。

目前，L-賴氨酸生產(chǎn)菌的正向代謝工程選育工作主要涉及酶的反饋抑制解除、前體物與輔酶NADPH供應增強、阻斷競爭代謝途徑等。其中，輔酶平衡對于L-賴氨酸的合成有非常重要的作用，因為合成1 mol L-賴氨酸需要消耗4 mol的NADPH。一系列代謝工程工作針對輔酶的平衡展開，一種策略是提高胞內(nèi)NADPH的供應，如增強磷酸戊糖途徑(PPP途徑) 以增加NADPH的合成[1]；通過引入吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶編碼基因pntAB強化NADH與NADPH之間的轉(zhuǎn)換；或者構(gòu)建新的NADPH合成途徑[5, 34]；另一種策略是將L-賴氨酸合成中的NADPH依賴改變?yōu)镹ADH依賴，減少對NADPH的需求。Wu等[6]嘗試在C. glutamicum中使用不同來源的NADH依賴的脫氫酶，以減少對于NADPH的消耗需求。結(jié)果表明，這種輔酶改造可有效地促進L-賴氨酸的生產(chǎn)。

代謝過程的動態(tài)調(diào)控是提升目標氨基酸合成效率的有效方式。在L-賴氨酸的正向代謝工程中，利用L-賴氨酸核糖開關進行相關基因的調(diào)控可以實現(xiàn)在不依賴外加誘導劑的條件下，利用胞內(nèi)L-賴氨酸對相關途徑進行自調(diào)控，以促進L-賴氨酸的生產(chǎn)。在E. coli與枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis中發(fā)現(xiàn)的L-賴氨酸核糖開關位于lysC基因的5′非翻譯區(qū)，在L-賴氨酸存在時，會抑制lysC的翻譯起始過程，是一種“l(fā)ysine-OFF”開關。Zhou等[21]在C. glutamicum中分別引入來自E. coli與B. subtilis的L-賴氨酸核糖開關，使其控制檸檬酸合酶(gltA) 的翻譯過程，從而對三羧酸循環(huán)產(chǎn)生負調(diào)控作用，使更多的前體物草酰乙酸用于L-賴氨酸的合成過程。所構(gòu)建的菌株分別使L-賴氨酸的產(chǎn)量提高了63%與38%。后來，他們通過進行tetA-依賴的雙重基因篩選，從“l(fā)ysine-OFF”開關構(gòu)建出了“l(fā)ysine-ON”開關[35]，并在C. glutamicum中對L-賴氨酸輸出蛋白(lysE) 進行“l(fā)ysine-ON”控制，對檸檬酸合酶(gltA) 進行“l(fā)ysine-OFF”控制，因而通過L-賴氨酸對目標合成途徑與競爭代謝途徑實現(xiàn)了協(xié)同的動態(tài)調(diào)控，有效提高了L-賴氨酸的轉(zhuǎn)化率。

目前，響應L-賴氨酸濃度構(gòu)建的生物傳感器在L-賴氨酸生產(chǎn)菌進化代謝工程育種中應用較多。一種傳感器類型是基于轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子LysG響應高濃度L-賴氨酸促進lysE基因的表達，將lysE基因與熒光蛋白基因融合，通過熒光激活細胞分選技術(shù)(Fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS) 篩選熒光信號強的細胞，獲得高產(chǎn)L-賴氨酸的菌株[36]。Kortmann等[37]利用此L-賴氨酸傳感器進行C. glutamicum中丙酮酸羧化酶突變體的篩選，通過FACS篩選獲得了有利于L-賴氨酸產(chǎn)量提升的丙酮酸羧化酶突變體，突變體PCxT132A與PCxT343A的基因組整合，可使L-賴氨酸的產(chǎn)量提升6%–14%。Wang等[38]在E. coli中利用L-賴氨酸傳感器從常壓室溫等離子體(Atmospheric Room Temperature Plasma，ARTP)誘變突變體庫中篩選到了產(chǎn)量、轉(zhuǎn)化率相比于出發(fā)菌株分別提升21%與9.05%的突變菌株MU-1。另一種傳感器類型是基于L-賴氨酸核糖開關與L-賴氨酸的結(jié)合，產(chǎn)生調(diào)控作用。如前所述，L-賴氨酸核糖開關識別細胞內(nèi)的L-賴氨酸，并抑制所調(diào)控基因的翻譯過程。Yang等[25]利用E. coli來源的L-賴氨酸核糖開關調(diào)控tetA的表達，當細胞內(nèi)L-賴氨酸濃度高時，tetA表達受阻，細胞不具有四環(huán)素抗性；TetA可以轉(zhuǎn)運Ni2+進入細胞，導致細胞死亡，若其表達受阻，則可避免Ni2+的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運，此時細胞可以在NiCl2環(huán)境中生長。通過選擇適當濃度的NiCl2作為選擇壓力，可以篩選L-賴氨酸產(chǎn)量高的菌株；他們利用此生物傳感器，對L-賴氨酸生產(chǎn)中對代謝流分配起關鍵作用的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc基因編碼) 進行了啟動子優(yōu)化，從構(gòu)建的ppc啟動子文庫中篩選對L-賴氨酸生產(chǎn)有利的啟動子。

2.3 L-蘇氨酸的代謝工程育種

L-蘇氨酸是人類與動物所必需的一種氨基酸，常作為飼料添加劑使用。目前，L-蘇氨酸的工業(yè)生產(chǎn)主要利用E. coli發(fā)酵進行，發(fā)酵產(chǎn)量可達120 g/L以上[31]。E. coli中L-蘇氨酸的代謝工程育種工作主要集中在正向代謝工程方面[39]：(1) 解除關鍵酶受到的反饋抑制[3, 40]。眾多研究通過在天冬氨酸激酶編碼基因thrA以及l(fā)ysC[41]中引入定點突變，解除天冬氨酸激酶Ⅰ與Ⅲ受到的反饋抑制，可有效提升L-蘇氨酸的產(chǎn)量。(2) 通過啟動子替換、增加拷貝數(shù)等強化L-蘇氨酸合成途徑中酶的表達。(3) 競爭代謝途徑及L-蘇氨酸利用途徑的阻斷。L-甲硫氨酸與L-賴氨酸的合成需要以L-蘇氨酸合成途徑中的代謝物為前體物，高絲氨酸琥珀酰轉(zhuǎn)移酶編碼基因metA、二氨基庚酸脫羧酶編碼基因lysA的敲除，可增強L-蘇氨酸的合成。甘氨酸、L-異亮氨酸的合成需要以L-蘇氨酸為前體物，蘇氨酸脫氫酶編碼基因tdh的敲除、蘇氨酸脫水酶編碼基因ilvA的突變可以減少L-蘇氨酸的降解。(4) NADPH供應的平衡優(yōu)化。1 mol L-蘇氨酸的合成需要3 mol NADPH，輔因子的平衡供應是L-蘇氨酸高效合成的有效保障[42-43]。(5) 強化輸出蛋白RhtA、RhtB、RhtC的表達，增強L-蘇氨酸的胞外輸出過程[3]；敲除thcC、絲氨酸/蘇氨酸運輸?shù)鞍拙幋a基因sstT[44]，阻斷L-蘇氨酸的胞內(nèi)攝取途徑。

這些正向代謝工程策略的綜合應用，獲得了許多L-蘇氨酸高產(chǎn)菌株，Lee等[3]利用系統(tǒng)代謝工程構(gòu)建的E. coli工程菌具有82.4 g/L的產(chǎn)量。然而，L-蘇氨酸的合成需要以TCA循環(huán)的草酰乙酸為前體物，因此，細胞生長與L-蘇氨酸生產(chǎn)存在碳流競爭，影響轉(zhuǎn)化率的進一步提升。Liu等[43]進行了碳流分布的雙階段動態(tài)調(diào)控，將發(fā)酵過程分為細胞生長階段與產(chǎn)物生產(chǎn)階段。在細胞生長階段異源表達丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶與檸檬酸合酶，促進TCA循環(huán)的進行，加快葡萄糖利用與細胞生長；在生產(chǎn)階段，利用IPTG誘導異源檸檬酸合酶的表達關閉，將碳代謝流引向L-蘇氨酸的合成途徑；同時，進行了NADPH再生系統(tǒng)的構(gòu)建，最終使L-蘇氨酸的生產(chǎn)在搖瓶和發(fā)酵罐水平分別提升了2.02倍和1.21倍。Fang等[45]利用cIts-pR-pL溫度感應開關控制丙酮酸羧化酶(pyc) 與L-蘇氨酸輸出蛋白(rhtC)，動態(tài)調(diào)控碳代謝在丙酮酸與草酰乙酸之間的分配，實現(xiàn)碳代謝流的動態(tài)平衡調(diào)控，顯著提高了L-蘇氨酸的轉(zhuǎn)化率；他們進一步利用此溫度開關關閉L-丙氨酸合成途徑后，使L-蘇氨酸的摩爾轉(zhuǎn)化率達到124.03%，展現(xiàn)了碳代謝流動態(tài)調(diào)控對L-蘇氨酸轉(zhuǎn)化率的有效提升。

3 分支鏈氨基酸代謝工程育種3.1 分支鏈氨基酸育種策略

分支鏈氨基酸(BCAAs)，即L-亮氨酸、L-異亮氨酸和L-纈氨酸，是哺乳動物的必需氨基酸[46]，主要生產(chǎn)菌株包括E. coli[47-48]和C. glutamicum[47, 49-50]。分支鏈氨基酸在C. glutamicum中的合成途徑如圖 2所示。三種分支鏈氨基酸合成過程中存在非常緊密的聯(lián)系，合成途徑存在若干共用的酶與前體物，并且利用相同的轉(zhuǎn)運蛋白進行胞外輸出。因此，3種分支鏈氨基酸在代謝工程改造中有很多相似的策略，如C. glutamicum中分支鏈氨基酸輸出蛋白BrnFE的強化[51-56]、分支鏈氨基酸攝取蛋白BrnQ的敲除[54, 56]、乙酰羥酸合酶IlvBN的反饋抑制解除[49, 57-58]、前體物丙酮酸的供應增強[49, 59]等基于理性設計的正向代謝工程策略(表 2)，以及基于組學分析與計算機模擬的反向代謝工程與基于生物傳感器的進化代謝工程[60-61]。

圖 2 C. glutamicum中分支鏈氨基酸的合成途徑Fig. 2 Biosynthesis pathway of branched-chain amino acids in C. glutamicum. Blue dashed lines indicate feedback inhibition, red dotted lines indicate feedback repression.

表 2 分支鏈氨基酸生產(chǎn)菌株的正向代謝工程研究進展Table 2 Summary of forward metabolic engineering for production of branched-chain amino acids

Amino acid Approaches Host Titer (g/L) Yield (g/g) Productivity (g/(L·h) References L-leucine ilvEmut, tyrB E. coli 2.70 0.038 [65] leuAmut E. coli 5.20 0.108 [62] leuAfbr, ΔilvE, Ptac-21-sucAB/pACYC-tyrB E. coli 11.40 0.158 [66] ΔilvE/pEC-XK99E-aspB C. glutamicum 20.81 0.174 0.289 [57] ΔltbR, AHAIRmut, rocG, ilvABNCmut, leuDH C. glutamicum 23.31 0.191 0.324 [63] ΔavtA, ΔiolR, ΔltbR, ΔgltA, ilvBNmut, Ptuf-leuA_B018, ΔPgltA: : PdapA-L1 C. glutamicum 24.00 0.218 0.330 [49] ΔilvA, ΔalaT, Δldh, ΔpanBC, ΔltbR, pZ8-1leuAfbr C. glutamicum 38.10 0.305 0.794 [59] ilvBNXV, leuCDCP, leuACP, bcdBsu, leuBCD, PgapA-pntABE. coli, Δldh, ΔilvA, ΔPgltA: : Pcp_2928 C. glutamicum 39.80 0.158 0.829 [12] L-isoleucine ilvAmut, ilvIHmut, thrABC, ygaZH, ilvCED, lrp E. coli 9.46 0.140 0.157 [52] SGr, α-ABAr, pTHR101 with a thr operon and ilvA, carbon source and glucose feeding strategy E. coli 11.95 [67] MH20-22Bmut, ilvAfbr, homfbr, dapAmut, ilvAmut, hommut, ΔPhom: : PcspB C. glutamicum 14.30 0.137 0.184 [68] thrABC, ΔalaT C. glutamicum 15.40 [69] JHI3-156/pDXW-8-lrp-brnFE C. glutamicum 26.90 0.122 0.374 [7] pDXW-8-fusA-frr-ilvA-ilvB-ilvN-ppnk C. glutamicum 28.50 0.139 0.360 [70] pDXW-8-gnd-pgl-fbp C. glutamicum 28.96 0.138 0.345 [71] ΔbrnQ, brnFE C. glutamicum 29.00 0.240 [53] TDfbr, AHASfbr C. glutamicum 30.70 0.120 0.426 [58] TDfbr, AHASfbr, ppnk C. glutamicum 32.30 [72] hom C. glutamicum 36.50 [73] ΔlacI, attilvG: : ptac, attilvB: : ptac, ilvHG41A, C50T, ΔilvA, ΔpanB, ΔleuA, ΔaceF, Δmdh, ΔpfkA: : KmR, pKBRilvBNmutCED, pTrc184ygaZHlrp E. coli 32.30 0.580 [15] ΔlacI, ΔilvA, overexpressing ilvBNmut, ilvCED, ygaZH, lrp E. coli 60.70 0.220 2.06 [74] ICDmut(G407S), Δppc, Δpyc, pJC4ilvBNCE, MGE analysis C. glutamicum 8.50 0.220 [60] ΔaceE/pJC4ilvBNCE, Δpqo C. glutamicum 35.20 0.130 [75] L-valine ΔaceE, Δpqo, Δpgi/pJC4ilvBNCE C. glutamicum 48.00 0.490 0.656 [76] ΔaceE, ΔalaT, ΔilvA/pJYW-4-ilvBNCVWB-1-lrpVWB-1-brnFE C. glutamicum 51.00 0.307 0.533 [55] ΔldhA Δppc Δpta ΔackA ΔctfA ΔavtA, ilvNGEC?, gapA, pyk, pfkA, pgi, tpi, /pCRB-BNGEC?, pCRB-DLD, oxygen deprivation conditions C. glutamicum 149.90 0.572 [77] ΔldhA, pCRB-BNfbrCmut, pCRB-DLD, oxygen deprivation conditions, 24 h C. glutamicum 172.20 0.409 [4] ΔldhA, pCRB-BNfbrCmut, pCRB-DLD, oxygen deprivation conditions, 48 h C. glutamicum 227.20 [4]

3.2 L-亮氨酸的代謝工程育種

由于3種分支鏈氨基酸在合成途徑上密切相關，它們的代謝工程策略存在很多相似之處，本文將主要以L-亮氨酸的代謝工程研究為代表進行介紹。目前，L-亮氨酸的代謝工程研究主要集中在正向代謝工程方面(表 2)：(1) 解除關鍵酶的反饋抑制是高效生產(chǎn)L-亮氨酸最重要的一步。眾多研究通過篩選解除反饋抑制的異丙基蘋果酸合酶編碼基因leuA突變體，提升了L-亮氨酸的產(chǎn)量[46, 49, 62]。Vogt等[49]通過對野生型菌株C. glutamicum B018的leuA點突變(G1586A, G1595A)，消除L-亮氨酸對異丙基蘋果酸合酶的反饋抑制，增強了L-亮氨酸生產(chǎn)的碳通量。(2) 合成途徑相關基因的強化。包括leuA、leuBCD等基因的直接過表達，以及抑制leuBCD轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子LtbR的敲除[63]等。(3) 前體物的供應增強。丙酮酸是產(chǎn)生BCAA的常見中間體，也用于生產(chǎn)其他競爭副產(chǎn)品，如乳酸、乙酸、L-丙氨酸等[46, 59]。Huang等[59]通過敲除ilvA基因、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶編碼基因alaT、乳酸脫氫酶編碼基因ldh、羥基酮泛酸甲基轉(zhuǎn)移酶和D-泛酸合酶編碼基因panBC，以減少副產(chǎn)物L-異亮氨酸、L-丙氨酸、乳酸、D-泛酸的形成，獲得的工程菌株MDLeu-19產(chǎn)量比對照菌株高出54.1%，在分批補料條件下，可積累38.1 g/L的L-亮氨酸。另一方面，大量的丙酮酸需要用于TCA循環(huán)，因此許多研究嘗試通過弱化TCA循環(huán)，使更多的丙酮酸用于分支鏈氨基酸的合成。崔毅[12]將TCA循環(huán)中檸檬酸合酶(gltA編碼) 啟動子替換為L-亮氨酸生產(chǎn)菌C. glutamicum CP中的特異性啟動子PCp-2928，從而使碳源在乙酰輔酶A代謝節(jié)點流向TCA循環(huán)的通量降低，獲得了L-亮氨酸工程菌AL13，L-亮氨酸產(chǎn)量達(13±0.1) g/L，比出發(fā)菌株提升了21倍。Vogt等[49]通過將較弱的啟動子PdapA-L1替換為檸檬酸合酶編碼基因gltA的啟動子，獲得的菌株MV-LeuF2比對照菌株L-亮氨酸產(chǎn)量增加了15%，副產(chǎn)物L-纈氨酸減少了69.3%。(4) 提高L-亮氨酸的轉(zhuǎn)運能力。Kutukova等[64]報道在E. coli中過表達編碼L-亮氨酸輸出蛋白編碼基因yeaS (leuE)，可以提高L-亮氨酸的產(chǎn)量。在C. glutamicum中，brnFE基因受到轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Lrp的正調(diào)控，研究報道brnFE和lrp過表達有利于L-亮氨酸的生物合成[51]。(5) 輔酶供應的平衡優(yōu)化。合成1 mol L-亮氨酸需要消耗2 mol NADPH。而在糖酵解過程中產(chǎn)生3 mol NADH。因此，NADH過剩和NADPH不足也會抑制L-亮氨酸的產(chǎn)生[78]。目前報道的策略主要有兩種類型：一種是增強NADPH的供應；另一種是改變相關酶的輔酶依賴性，改變對NADPH的需求。Cui等[12]引入了E. coli中的吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶編碼基因pntAB，并由啟動子PgapA控制轉(zhuǎn)錄，以提高胞內(nèi)NADPH的轉(zhuǎn)化合成。構(gòu)建的L-亮氨酸工程菌產(chǎn)量達到12.5 g/L，是出發(fā)菌株的19.8倍。Wang等[63]通過引入異源NADH依賴的亮氨酸脫氫酶LeuDH和谷氨酸脫氫酶RocG，替換內(nèi)源性依賴NADPH的支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶TA和谷氨酸脫氫酶GDH，有效地利用NADH生產(chǎn)L-亮氨酸，最終菌株積累了(23.31±0.24) g/L的L-亮氨酸，葡萄糖轉(zhuǎn)化效率達到0.191 g/g。

在進化代謝工程方面，除前面提到的利用基于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Lrp的生物傳感器[51]進行篩選外，Zheng等[79]報道了利用稀有密碼子從E. coli突變體庫中篩選L-亮氨酸菌株。分別將抗性基因(kanR和specR) 和顏色蛋白編碼基因(gfp和ppg) 中的L-亮氨酸密碼子替換為稀有密碼子，建立以生長水平和顏色標記為指示的兩類篩選體系。當細胞內(nèi)L-亮氨酸合成增強時，稀有密碼子對應的tRNA得以被額外的氨基酸“裝載”，從而恢復了由稀有密碼子編碼的抗性蛋白的翻譯，菌體生長得以恢復，這種基于稀有密碼子的篩選策略為氨基酸高產(chǎn)菌株的篩選和改造提供了一種不同于類似物篩選的新系統(tǒng)，克服了使用類似物篩選存在的高毒性、低陽性率和適用種類有限等缺點，理論上可以用于任何一種天然氨基酸高產(chǎn)菌株的篩選；同時也為氨基酸高產(chǎn)機制的發(fā)現(xiàn)和高產(chǎn)菌株的構(gòu)建提供了新的思路。

4 芳香族氨基酸代謝工程育種4.1 芳香族氨基酸育種策略

芳香族氨基酸包括L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸，它們在高分子材料、食品、保健品、藥品等領域有重要的應用，是一類具有高附加值的氨基酸品種，目前主要利用模式微生物E. coli[80-82]、釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae、C. glutamicum[83]等進行生產(chǎn)。其中，E. coli中芳香族氨基酸的代謝工程研究報道最多。芳香族氨基酸在E. coli中的合成途徑如圖 3所示，從圖中可以看出，芳香族氨基酸的合成過程主要由共同的莽草酸途徑與各自的分支途徑組成，其中，L-苯丙氨酸與L-酪氨酸的合成途徑更為相似，而L-色氨酸的合成途徑則更為復雜，存在終產(chǎn)物L-色氨酸的反饋阻遏、反饋抑制、弱化調(diào)節(jié)等多重調(diào)控機制。目前，芳香族氨基酸的正向代謝工程研究(表 3) 主要集中在兩方面[84]，一方面是中心碳代謝的改造，增強前體物PEP與E4P的供應，同時提高PEP與E4P的縮合效率，提高莽草酸途徑強度；另一方面是解除分支途徑關鍵酶受到的反饋調(diào)節(jié)，強化分支合成效率。

圖 3 E. coli中芳香族氨基酸的合成途徑Fig. 3 Biosynthesis pathway of aromatic amino acids in E. coli. Blue dashed lines indicate feedback inhibition, and red dotted lines indicate feedback repression. The shared chorismate synthesis pathway and the three branched synthesis pathways are highlighted in different colors.

表 3 芳香族氨基酸生產(chǎn)菌株的正向代謝工程研究進展Table 3 Summary of forward metabolic engineering for production of aromatic amino acids

Amino acid Approaches Host Titer (g/L) Yield (g/g) Productivity (g/(L·h) References L-Tyr ΔtyrR/pCL1920:: PLtetO?1aroGfbrtyrAfbrppsAtktAb E. coli? 9.70 0.102 [88] Global transcription machinery engineering E. coli? 13.80 0.120 [82] Small regulatory RNAs engineering E. coli? 21.90 [89] ΔtnaA, Δmtr, yjiv: : Ptrc-aroG, yghx: : Ptrc-trpE, yyrk: : Plac-trpD, ycjv: : Pser-serA, repeated batch fermentation E. coli? 45.60 0.301 2.53 [90] aroGfbr, tyrRmut, ΔpheLA, Ptrc-tyrA E. coli? 55.00 0.300 [91] ΔpheA, ΔtyrR/pAP-aroGfbr-tyrAfbr E. coli 55.54 0.250 1.38 [92] L-Phe ΔpheA, ΔtyrA, ΔaroF, Δlac: : Ptac: : aroFBL+, Δrbs: : Ptac: : glpX, Δgal: : Ptac: : tktA-cat/pF81(Ptac: : aroF, pheAfbr, aroB, aroL, AmpR, lacI) E. coli? 10.10 0.37 [85] ΔptsI: : iolT2-ppgK, ΔaroP, ΔaceE, Δldh C. glutamicum 15.76 [93] pheAfbr, ydiB, aroK, aroG15 E. coli? 23.80 0.154 0.073 [94] ΔpheA, ΔtyrA, ΔaroF, aroFfbr, pheAfbr E. coli? 32.00 [95] ΔpheA, ΔtyrA, ΔaroF/pJF119EH-aroFmut-pheAfbr-aroLmut E. coli? 35.00 [96] L-tyrosine auxotrophic E. coli? 35.38 0.238 0.61 [97] Multiple random mutagenesis, aroFmut, pheAfbr E. coli? 57.63 0.242 1.153 [98] Multiple random mutagenesis, aroFmut, pheAfbr, aroA E. coli? 62.47 0.236 [99] L-tyrosine auxotrophic, ΔtyrR, aroFmut, aroD, pheAfbr, galP, glk E. coli? 72.90 0.259 [100] L-Try ΔtrpR, ΔtraA, ΔptsG, with tryptophan attenuator deletion and trp promoter swapping by 5CPtacs promoter cluster, ΔaroP, ΔtnaB, Δmtr/pCL1920-aroGfbr-trpEfbr-tktA E. coli? 16.30 [101] ΔtnaA, trpEDCBA, yddG E. coli? 36.30 [102] aroGfbr, trpEDCBA, ΔpykF, ΔptsH, ΔtrpR, Δattenuator, ΔtrpL, galP, glk, repressing pta E. coli? 39.70 0.167 1.6 [103] ΔlacU169, gal490λC1857, Δ(cro-bioA), rpsL, (StrR), ΔaroF, ΔaroG, Δmtr, ΔtnaA, ΔtnaB, ?λa, ΔaroH: : PJ23119-rpsL-tac-(aroGS180F-serAH344A/N364A) Ptrc-trpES40FDCBA E. coli? 40.30 0.150 0.6 [10] serA6 lacU169 tna2/pBE7-PlacUV5-aroGfbr-PlacUV5-trpEfbr E. coli? 42.30 0.176 [104] ΔtrpR, ΔtnaA, ΔpheA, ΔtyrA, pta: : pta1/pSTV-03-aroFfbr-trpEfbrD E. coli? 44.00 0.130 0.82 [105] ΔtnaA, ΔgltA, Δpta, ΔackA, ΔpoxB, trpEDCBA E. coli? 47.18 0.156 [106] ΔtrpR, ΔtnaA, Δpta, Δmtr, aroGfbr trpERDCBA, serA, tktA, ppsA, yddG E. coli? 48.68 0.218 [107]

PEP與E4P是莽草酸途徑的前體物，而這兩種物質(zhì)的來源均與中心碳代謝過程有關。增強PEP供應的策略包括阻斷或減弱PEP的消耗途徑(如敲除ppc、pykA、pykF基因，用非磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(non-PTS) 系統(tǒng)替換PTS系統(tǒng)進行糖利用等)，以及增強PEP的合成(如過表達pps、pck基因等)。E4P是磷酸戊糖途徑的中間產(chǎn)物，已有報道表明，增強轉(zhuǎn)酮醇酶(tktA編碼)[85]的表達，可以增強E4P的供應，利于芳香族氨基酸的合成。除此之外，也有阻斷糖酵解途徑，以強化磷酸戊糖途徑的嘗試，但往往對于細胞生長有損害[86]。因此，如何動態(tài)重構(gòu)中心碳代謝與芳香族氨基酸合成之間的平衡，在保障細胞正常生長前提下，使更多的代謝流用于芳香族氨基酸的合成，是提升芳香族氨基酸產(chǎn)量與轉(zhuǎn)化率的關鍵。

響應芳香族氨基酸的生物傳感器構(gòu)建已有文獻報道，如Yang等[25]在構(gòu)建L-賴氨酸響應核糖開關時，采用類似的方法構(gòu)建了L-色氨酸響應的核糖開關；Chou等[23]基于TyrR響應L-酪氨酸對aroF的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，在E. coli中構(gòu)建了表型進化的反饋控制(Feedback-regulated evolution of phenotype，F(xiàn)REP) 系統(tǒng)，隨著L-酪氨酸胞內(nèi)濃度的升高，不斷減慢基因突變速率，最終獲得了L-酪氨酸產(chǎn)量提高了5倍的菌株。Mahr等[26]基于mtr基因(編碼L-色氨酸轉(zhuǎn)運蛋白) 的啟動子，成功構(gòu)建了響應L-苯丙氨酸的生物傳感器，并從E. coli K-12 MG1655突變體庫中篩選到了L-苯丙氨酸產(chǎn)量提升的菌株。未來隨著這些生物傳感器的不斷發(fā)展，它們將在芳香族氨基酸進化代謝工程中發(fā)揮重要的作用。

4.2 L-色氨酸的代謝工程育種

三種芳香族氨基酸在代謝工程育種策略上存在很多相似之處，在此主要以L-色氨酸的代謝工程育種進展為代表，進行詳細介紹。在E. coli中，AroF、AroG與AroH為3個同工酶，共同催化莽草酸途徑的第一步縮合反應，它們分別受到L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸的反饋抑制，其中AroG與AroF分別占據(jù)80%、20%的DAHP合成酶活性[87]，因此很多研究中進行AroG、AroF解反饋抑制基因的強化表達來增強莽草酸途徑[108]。L-色氨酸分支合成途徑中的酶以trpEDCBA操縱子結(jié)構(gòu)存在，基因表達受到L-色氨酸的反饋阻遏與弱化調(diào)節(jié)。因此，篩選解除反饋抑制的突變體酶被眾多研究表明是芳香族氨基酸合成途徑強化的有效手段[82, 94, 108-110]。除此之外，轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子TrpR對trpEDCBA、aroH、trpR、mtr、aroL存在L-色氨酸依賴的轉(zhuǎn)錄阻遏調(diào)控[108]，可以通過敲除trpR基因或者引入突變解除阻遏。由于這些反饋抑制、轉(zhuǎn)錄調(diào)控都依賴L-色氨酸，降低細胞內(nèi)L-色氨酸的濃度，也可以緩解負面調(diào)控的影響。Zhao等[111]比較發(fā)現(xiàn)E. coli中L-色氨酸攝取蛋白Mtr、TnaB、AroP的敲除對于L-色氨酸生產(chǎn)都有促進作用，其中mtr基因的敲除作用作為明顯，使L-色氨酸的產(chǎn)量相比對照提高了34%。Liu等[102]在一株L-色氨酸生產(chǎn)菌E. coli TRTH中表達芳香族氨基酸分泌蛋白YddG，增強輸出過程，進而影響細胞代謝流分布，促進L-色氨酸的生產(chǎn)。

2018年，Chen等[112]發(fā)現(xiàn)E. coli中的L-色氨酸合成分支中不僅存在以上的反饋調(diào)節(jié)，還存在前饋調(diào)節(jié)，trpC編碼的吲哚甘油磷酸合成酶受到鄰氨基苯甲酸的非競爭性前饋抑制，trpC中鄰氨基苯甲酸結(jié)合位點突變后提高了L-色氨酸的合成。而在黑曲霉Aspergillus niger中的trpC則受到鄰氨基苯甲酸的前饋激活調(diào)節(jié)，在L-色氨酸生產(chǎn)菌E. coli中引入來自A. niger的trpC，使L-色氨酸產(chǎn)量與轉(zhuǎn)化率分別由19 g/L、0.15 g/g提高到29 g/L與0.18 g/g[112]。

L-色氨酸合成的復雜性，一方面是由于存在上述復雜調(diào)控；另一方面，L-色氨酸的合成除了需要PEP與E4P作為前體物之外，還需要L-絲氨酸、谷氨酰胺以及5-磷酸-α-D-核糖-1-二磷酸鹽(PRPP) 作為前體物，前體物的協(xié)調(diào)供應涉及眾多代謝過程。Li等[113]對這些前體物的供應進行了增強；同時進行了輔因子平衡，獲得了L-色氨酸產(chǎn)量比出發(fā)菌株高2.76倍的E. coli工程菌。

5 其他氨基酸代謝工程育種

隨著氨基酸產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，小品種氨基酸作為高附加值氨基酸，其市場應用不斷拓展，市場需求不斷上漲，成為氨基酸行業(yè)發(fā)展的新型趨勢。近年來，采用系統(tǒng)代謝工程方法進行高附加值氨基酸微生物生產(chǎn)的研究不斷涌現(xiàn)。Wu等[114]在E. coli中解除L-組氨酸的反饋抑制、強化L-組氨酸合成途徑的酶表達、增強磷酸核糖焦磷酸的供應、改變嘌呤核苷酸合成路徑、引入來自B. subtilis的NADH依賴的谷氨酸脫氫酶以及來自C. glutamicum的L-賴氨酸輸出蛋白等，最終在5 L發(fā)酵罐中獲得了高達66.5 g/L的L-組氨酸產(chǎn)量。Zhang等[115]利用CRISPR-Cpf1基因組編輯系統(tǒng)進行了C. glutamicum 13032中L-脯氨酸生產(chǎn)的系統(tǒng)代謝工程構(gòu)建。通過解除谷氨酸5-激酶ProB受到的反饋抑制并增強其表達、敲除脯氨酸脫氫酶以阻斷L-脯氨酸的分解、增強谷氨酸合成、增強NADPH供應、減少副產(chǎn)物L-丙氨酸合成等策略，獲得了菌株ZQJY-9，在3 L發(fā)酵罐中獲得了120.18 g/L的L-脯氨酸產(chǎn)量。由于高濃度的L-絲氨酸對E. coli具有毒性，因此限制了L-絲氨酸的高效生產(chǎn)。Mundhada等[116]利用適應性進化策略，首先阻斷E. coli中的L-絲氨酸利用途徑，然后在適應性進化中逐漸將L-絲氨酸濃度由3 g/L上升到100 g/L，最終獲得的優(yōu)勢菌株在thrA、rho、lrp、pykF、eno、rpoB基因存在突變，產(chǎn)量達到37 g/L，展示了適應性進化在代謝工程中的巨大應用潛力。后來，Rennig等[117]在E. coli中將L-絲氨酸合成途徑中的serAmut、serC、serB基因構(gòu)建在一個操縱子上，并利用抗生素抗性作為篩選標記對serAmutCB操縱子進行了翻譯起始區(qū)域文庫篩選，最終在1 L發(fā)酵罐中獲得了50 g/L的L-絲氨酸。四氫嘧啶，是一種特殊的環(huán)化氨基酸，具有保濕抗衰老等功能，在化妝品行業(yè)具有重要應用。傳統(tǒng)采用“細菌擠奶”技術(shù)從嗜鹽菌中生產(chǎn)，Ning等[118]在E. coli中質(zhì)粒表達源自伸長嗜鹽菌Halomonas elongata的四氫嘧啶合成基因簇ectABC，并進行前體物供應協(xié)調(diào)，在7.5 L發(fā)酵罐獲得了25.1 g/L的四氫嘧啶。未來隨著代謝工程技術(shù)的不斷發(fā)展，必將有更多的高附加值氨基酸及其衍生物實現(xiàn)微生物的高效率生產(chǎn)。

6 氨基酸代謝工程育種的發(fā)展趨勢

近30年來，代謝工程在中國迅速發(fā)展，在氨基酸與其他化學品的生產(chǎn)菌株選育中發(fā)揮著與日俱增的作用。在氨基酸的代謝工程育種方面，正向代謝工程、反向代謝工程與進化代謝工程都獲得了一系列高產(chǎn)優(yōu)勢菌株。隨著相關技術(shù)的不斷發(fā)展，氨基酸代謝工程育種主要有以下發(fā)展趨勢。

(1) 動態(tài)代謝工程

氨基酸作為初級代謝產(chǎn)物，它們的合成通常伴隨細胞的生長過程，以中心碳代謝過程的中間物質(zhì)作為前體物，因此，細胞生長是目標氨基酸生產(chǎn)的重要保障；然而，在氨基酸快速生產(chǎn)階段，流向中心碳代謝的代謝流勢必會導致目標氨基酸轉(zhuǎn)化率的降低。因此，在氨基酸代謝工程育種的未來發(fā)展中，動態(tài)調(diào)控細胞代謝過程，實現(xiàn)細胞生長與氨基酸生產(chǎn)的平衡重構(gòu)，對于提高目標氨基酸的轉(zhuǎn)化率與生產(chǎn)效率具有重要的作用。近年來，動態(tài)代謝工程的應用越來越多，一系列基于溫度[45]、誘導劑[119]、胞內(nèi)代謝產(chǎn)物[120]等誘導因素進行的動態(tài)調(diào)控不斷涌現(xiàn)，在提高目標產(chǎn)品的高效合成方面有非常顯著的作用。因此，動態(tài)代謝工程是氨基酸代謝工程育種的一個重要發(fā)展方向。

(2) 高附加值氨基酸及衍生物的代謝工程育種

隨著大宗氨基酸品種的市場不斷趨于飽和，小品種氨基酸、非蛋白質(zhì)氨基酸、環(huán)化氨基酸、氨基酸衍生物等新型產(chǎn)品的需求不斷增長，具有廣闊的市場應用前景。因此，這些新品種氨基酸的代謝工程育種將成為氨基酸行業(yè)發(fā)展的熱點。綜合運用系統(tǒng)代謝工程策略，選育高產(chǎn)量/高轉(zhuǎn)化率/高生產(chǎn)強度、穩(wěn)定遺傳的新產(chǎn)品生產(chǎn)菌株是氨基酸行業(yè)發(fā)展的重要趨勢。

(3) 系統(tǒng)代謝工程的綜合應用

盡管基于組學分析與計算機模擬的代謝工程與進化代謝工程在氨基酸的代謝工程育種方面展現(xiàn)出了強大的功能，但目前氨基酸的代謝工程育種仍然以基于理性設計的正向代謝工程為主。進一步開發(fā)組學數(shù)據(jù)的整合分析方法，完善計算機模擬技術(shù)方法，開發(fā)構(gòu)建新的生物傳感技術(shù)等對于充分發(fā)揮反向代謝工程與進化代謝工程的作用，推動氨基酸的代謝工程育種效率具有重要的意義。

(4) 基于工藝革新的代謝工程改造

傳統(tǒng)的氨基酸發(fā)酵一般采用好氧發(fā)酵，依賴TCA循環(huán)提供能量、進行輔酶循環(huán)。L-纈氨酸、L-丙氨酸等氨基酸需要以丙酮酸為前體物，在好氧發(fā)酵時，大量丙酮酸進入TCA循環(huán)，進行細胞代謝，從而導致目標氨基酸的轉(zhuǎn)化率較低。近年來，通過基因改造改變相關酶的輔酶依賴性或者引入異源酶實現(xiàn)厭氧發(fā)酵或雙階段發(fā)酵，對于氨基酸的轉(zhuǎn)化率有顯著的提升作用。新的工藝可以減少能源的消耗，提高原料的利用率，有效降低成本。未來基于工藝革新需求，開發(fā)與節(jié)能減排、低成本原料利用等相匹配的菌株，是氨基酸代謝工程育種的新趨勢。

代謝工程在中國快速發(fā)展的30年來為氨基酸行業(yè)注入了新的活力，同時也帶來了新的挑戰(zhàn)與機遇，在市場競爭日趨劇烈的今天，優(yōu)良菌株的選育成為氨基酸生產(chǎn)企業(yè)制勝的法寶，隨著科研力量的不斷投入，氨基酸行業(yè)必將迎來更加蓬勃的發(fā)展。

參考文獻

[1]

Becker J, Zelder O, H?fner S, et al. From zero to hero — design-based systems metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum for L-lysine production. Metab Eng, 2011, 13(2): 159-168. DOI:10.1016/j.ymben.2011.01.003

[2]

Park SD, Lee JY, Sim SY, et al. Characteristics of methionine production by an engineered Corynebacterium glutamicum strain. Metab Eng, 2007, 9(4): 327-336. DOI:10.1016/j.ymben.2007.05.001

[3]

Lee KH, Park JH, Kim TY, et al. Systems metabolic engineering of Escherichia coli for L-threonine production. Mol Syst Biol, 2007, 3(1): 149. DOI:10.1038/msb4100196

[4]

Hasegawa S, Uematsu K, Natsuma Y, et al. Improvement of the redox balance increases L-valine production by Corynebacterium glutamicum under oxygen deprivation conditions. Appl Environ Microbiol, 2012, 78(3): 865-875. DOI:10.1128/AEM.07056-11

[5]

Bommareddy RR, Chen Z, Rappert S, et al. A de novo NADPH generation pathway for improving lysine production of Corynebacterium glutamicum by rational design of the coenzyme specificity of glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase. Metab Eng, 2014, 25: 30-37. DOI:10.1016/j.ymben.2014.06.005

[6]

Wu WJ, Zhang Y, Liu DH, et al. Efficient mining of natural NADH-utilizing dehydrogenases enables systematic cofactor engineering of lysine synthesis pathway of Corynebacterium glutamicum. Metab Eng, 2019, 52: 77-86. DOI:10.1016/j.ymben.2018.11.006

[7]

Yin L, Shi F, Hu X, et al. Increasing L-isoleucine production in Corynebacterium glutamicum by overexpressing global regulator lrp and two-component export system BrnFE. J Appl Microbiol, 2013, 114(5): 1369-1377. DOI:10.1111/jam.12141

[8]

Eli?áková V, Pátek M, Holátko J, et al. Feedback-resistant acetohydroxy acid synthase increases valine production in Corynebacterium glutamicum. Appl Environ Microbiol, 2005, 71(1): 207-213. DOI:10.1128/AEM.71.1.207-213.2005

[9]

Prokhorova IV, Osterman IA, Burakovsky DE, et al. Modified nucleotides m(2)G966/m(5)C967 of Escherichia coli 16S rRNA are required for attenuation of tryptophan operon. Sci Rep, 2013, 3: 3236. DOI:10.1038/srep03236

[10]

Chen L, Zeng AP. Rational design and metabolic analysis of Escherichia coli for effective production of L-tryptophan at high concentration. Appl Microbiol Biotechnol, 2017, 101(2): 559-568. DOI:10.1007/s00253-016-7772-5

[11]

Hirasawa T, Shimizu H. Recent advances in amino acid production by microbial cells. Curr Opin Biotechnol, 2016, 42: 133-146. DOI:10.1016/j.copbio.2016.04.017

[12]

崔毅. 代謝工程改造谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)L-亮氨酸. 天津: 天津科技大學, 2019.
Cui Y. Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum for L-leucine production. Tianjin: Tianjin University of Science & Technology, 2019 (in Chinese).

[13]

Ohnishi J, Mitsuhashi S, Hayashi M, et al. A novel methodology employing Corynebacterium glutamicum genome information to generate a new L-lysine-producing mutant. Appl Microbiol Biotechnol, 2002, 58(2): 217-223. DOI:10.1007/s00253-001-0883-6

[14]

Ma Q, Zhang QW, Xu QY, et al. Systems metabolic engineering strategies for the production of amino acids. Synth Syst Biotechnol, 2017, 2(2): 87-96. DOI:10.1016/j.synbio.2017.07.003

[15]

Park JH, Kim TY, Lee KH, et al. Fed-batch culture of Escherichia coli for L-valine production based on in silico flux response analysis. Biotechnol Bioeng, 2011, 108(4): 934-946. DOI:10.1002/bit.22995

[16]

Lee JW, Na D, Park JM, et al. Systems metabolic engineering of microorganisms for natural and non-natural chemicals. Nat Chem Biol, 2012, 8(6): 536-546. DOI:10.1038/nchembio.970

[17]

Long MF, Xu MJ, Qiao ZN, et al. Directed Evolution of ornithine cyclodeaminase using an EvolvR-based growth-coupling strategy for efficient biosynthesis of L-proline. ACS Synth Biol, 2020, 9(7): 1855-1863. DOI:10.1021/acssynbio.0c00198

[18]

Mahr R, G?tgens C, G?tgens J, et al. Biosensor-driven adaptive laboratory evolution of L-valine production in Corynebacterium glutamicum. Metab Eng, 2015, 32: 184-194. DOI:10.1016/j.ymben.2015.09.017

[19]

Liu D, Evans T, Zhang FZ. Applications and advances of metabolite biosensors for metabolic engineering. Metab Eng, 2015, 31: 35-43. DOI:10.1016/j.ymben.2015.06.008

[20]

Mustafi N, Grünberger A, Kohlheyer D, et al. The development and application of a single-cell biosensor for the detection of L-methionine and branched-chain amino acids. Metab Eng, 2012, 14(4): 449-457. DOI:10.1016/j.ymben.2012.02.002

[21]

Zhou LB, Zeng AP. Exploring lysine riboswitch for metabolic flux control and improvement of L-lysine synthesis in Corynebacterium glutamicum. ACS Synth Biol, 2015, 4(6): 729-734. DOI:10.1021/sb500332c

[22]

Zhou L, Ren J, Li Z, et al. Characterization and engineering of a Clostridium glycine riboswitch and its use to control a novel metabolic pathway for 5-aminolevulinic acid production in Escherichia coli. ACS Synth Biol, 2019, 8(10): 2327-2335. DOI:10.1021/acssynbio.9b00137

[23]

Chou HH, Keasling JD. Programming adaptive control to evolve increased metabolite production. Nat Commun, 2013, 4: 2595. DOI:10.1038/ncomms3595

[24]

Binder S, Siedler S, Marienhagen J, et al. Recombineering in Corynebacterium glutamicum combined with optical nanosensors: a general strategy for fast producer strain generation. Nucleic Acids Res, 2013, 41(12): 6360-6369. DOI:10.1093/nar/gkt312

[25]

Yang JN, Seo SW, Jang S, et al. Synthetic RNA devices to expedite the evolution of metabolite- producing microbes. Nat Commun, 2013, 4: 1413. DOI:10.1038/ncomms2404

[26]

Mahr R, Von Boeselager RF, Wiechert J, et al. Screening of an Escherichia coli promoter library for a phenylalanine biosensor. Appl Microbiol Biotechnol, 2016, 100(15): 6739-6753. DOI:10.1007/s00253-016-7575-8

[27]

Shi T, Ma Q, Liu XQ, et al. Double deletion of murA and murB induced temperature sensitivity in Corynebacterium glutamicum. Bioengineered, 2019, 10(1): 561-573. DOI:10.1080/21655979.2019.1685058

[28]

Shi T, Fan XG, Wu YS, et al. Mutation of genes for cell membrane synthesis in Corynebacterium glutamicum causes temperature-sensitive trait and promotes L-glutamate excretion. Biotechnol Biotechnol Equip, 2020, 34(1): 38-47. DOI:10.1080/13102818.2019.1711186

[29]

Krumbach K, Sonntag CK, Eggeling L, et al. CRISPR/Cas12a mediated genome editing to introduce amino acid substitutions into the mechanosensitive channel MscCG of Corynebacterium glutamicum. ACS Synth Biol, 2019, 8(12): 2726-2734. DOI:10.1021/acssynbio.9b00361

[30]

Cleto S, Jensen JVK, Wendisch VF, et al. Corynebacterium glutamicum metabolic engineering with CRISPR interference (CRISPRi). ACS Synth Biol, 2016, 5(5): 375-385. DOI:10.1021/acssynbio.5b00216

[31]

Li YJ, Wei HB, Wang T, et al. Current status on metabolic engineering for the production of L-aspartate family amino acids and derivatives. Bioresour Technol, 2017, 245: 1588-1602. DOI:10.1016/j.biortech.2017.05.145

[32]

Ikeda M, Ohnishi J, Hayashi M, et al. A genome-based approach to create a minimally mutated Corynebacterium glutamicum strain for efficient L-lysine production. J Ind Microbiol Biotechnol, 2006, 33(7): 610-615. DOI:10.1007/s10295-006-0104-5

[33]

Ye C, Luo QL, Guo L, et al. Improving lysine production through construction of an Escherichia coli enzyme-constrained model. Biotechnol Bioeng, 2020, 117(11): 3533-3544. DOI:10.1002/bit.27485

[34]

Takeno S, Hori K, Ohtani S, et al. L-lysine production independent of the oxidative pentose phosphate pathway by Corynebacterium glutamicum with the Streptococcus mutans gapN gene. Metabo Eng, 2016, 37: 1-10. DOI:10.1016/j.ymben.2016.03.007

[35]

Zhou LB, Zeng AP. Engineering a lysine-ON riboswitch for metabolic control of lysine production in Corynebacterium glutamicum. ACS Synth Biol, 2015, 4(12): 1335-1340. DOI:10.1021/acssynbio.5b00075

[36]

Binder S, Schendzielorz G, St?bler N, et al. A high-throughput approach to identify genomic variants of bacterial metabolite producers at the single-cell level. Genome Biol, 2012, 13(5): R40. DOI:10.1186/gb-2012-13-5-r40

[37]

Kortmann M, Mack C, Baumgart M, et al. Pyruvate carboxylase variants enabling improved lysine production from glucose identified by biosensor-based high-throughput fluorescence- activated cell sorting screening. ACS Synth Biol, 2019, 8(2): 274-281. DOI:10.1021/acssynbio.8b00510

[38]

Wang Y, Li QG, Zheng P, et al. Evolving the L-lysine high-producing strain of Escherichia coli using a newly developed high-throughput screening method. J Ind Microbiol Biotechnol, 2016, 43(9): 1227-1235. DOI:10.1007/s10295-016-1803-1

[39]

Dong XY, Quinn PJ, Wang XY. Metabolic engineering of Escherichia coli and Corynebacterium glutamicum for the production of L-threonine. Biotechnol Adv, 2011, 29(1): 11-23. DOI:10.1016/j.biotechadv.2010.07.009

[40]

Livshits VA, Zakataeva NP, Aleshin VV, et al. Identification and characterization of the new gene rhtA involved in threonine and homoserine efflux in Escherichia coli. Res Microbiol, 2003, 154(2): 123-135. DOI:10.1016/S0923-2508(03)00036-6

[41]

Ogawa-Miyata Y, Kojima H, Sano K. Mutation analysis of the feedback inhibition site of aspartokinase Ⅲ of Escherichia coli K-12 and its use in L-threonine production. Biosci Biotechnol Biochem, 2001, 65(5): 1149-1154. DOI:10.1271/bbb.65.1149

[42]

Xie XX, Liang Y, Liu HL, et al. Modification of glycolysis and its effect on the production of L-threonine in Escherichia coli. J Ind Microbiol Biotechnol, 2014, 41(6): 1007-1015. DOI:10.1007/s10295-014-1436-1

[43]

Liu JH, Li HL, Xiong H, et al. Two-stage carbon distribution and cofactor generation for improving L-threonine production of Escherichia coli. Biotechnol Bioeng, 2019, 116(1): 110-120. DOI:10.1002/bit.26844

[44]

Lee JH, Sung BH, Kim MS, et al. Metabolic engineering of a reduced-genome strain of Escherichia coli for L-threonine production. Microb Cell Fact, 2009, 8: 2. DOI:10.1186/1475-2859-8-2

[45]

Fang Y, Wang JL, Ma WJ, et al. Rebalancing microbial carbon distribution for L-threonine maximization using a thermal switch system. Metab Eng, 2020, 61: 33-46. DOI:10.1016/j.ymben.2020.01.009

[46]

Yamamoto K, Tsuchisaka A, Yukawa H. Branched-chain amino acids. Adv Biochem Eng Biotechnol, 2017, 159: 103-128.

[47]

Wendisch VF, Bott M, Eikmanns BJ. Metabolic engineering of Escherichia coli and Corynebacterium glutamicum for biotechnological production of organic acids and amino acids. Curr Opin Microbiol, 2006, 9(3): 268-274. DOI:10.1016/j.mib.2006.03.001

[48]

Wang YY, Xu JZ, Zhang WG. Metabolic engineering of L-leucine production in Escherichia coli and Corynebacterium glutamicum: a review. Crit Rev Biotechnol, 2019, 39(5): 633-647. DOI:10.1080/07388551.2019.1577214

[49]

Vogt M, Haas S, Klaffl S, et al. Pushing product formation to its limit: metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum for L-leucine overproduction. Metab Eng, 2014, 22: 40-52. DOI:10.1016/j.ymben.2013.12.001

[50]

Zahoor A, Lindner SN, Wendisch VF. Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum aimed at alternative carbon sources and new products. Comput Struct Biotechnol J, 2012, 3: e201210004. DOI:10.5936/csbj.201210004

[51]

Lange C, Mustafi N, Frunzke J, et al. Lrp of Corynebacterium glutamicum controls expression of the brnFE operon encoding the export system for L-methionine and branched-chain amino acids. J Biotechnol, 2012, 158(4): 231-241. DOI:10.1016/j.jbiotec.2011.06.003

[52]

Park JH, Oh JE, Lee KH, et al. Rational design of Escherichia coli for L-isoleucine production. ACS Synth Biol, 2012, 1(11): 532-540. DOI:10.1021/sb300071a

[53]

Xie XX, Xu LL, Shi JM, et al. Effect of transport proteins on L-isoleucine production with the L-isoleucine-producing strain Corynebacterium glutamicum YILW. J Ind Microbiol Biotechnol, 2012, 39(10): 1549-1556. DOI:10.1007/s10295-012-1155-4

[54]

Zhang YC, Liu YD, Zhang SY, et al. Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum WM001 to improve L-isoleucine production. Biotechnol Appl Biochem, 2020. DOI:10.1002/bab.1963

[55]

Chen C, Li YY, Hu JY, et al. Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum ATCC13869 for L-valine production. Metab Eng, 2015, 29: 66-75. DOI:10.1016/j.ymben.2015.03.004

[56]

Zhang H, Li Y, Wang C, et al. Understanding the high L-valine production in Corynebacterium glutamicum VWB-1 using transcriptomics and proteomics. Sci Rep, 2018, 8: 3632. DOI:10.1038/s41598-018-21926-5

[57]

Feng LY, Xu JZ, Zhang WG. Improved L-leucine production in Corynebacterium glutamicum by optimizing the aminotransferases. Molecules, 2018, 23(9): 2102. DOI:10.3390/molecules23092102

[58]

Yin LH, Hu XQ, Xu DQ, et al. Co-expression of feedback-resistant threonine dehydratase and acetohydroxy acid synthase increase L-isoleucine production in Corynebacterium glutamicum. Metab Eng, 2012, 14(5): 542-550. DOI:10.1016/j.ymben.2012.06.002

[59]

Huang QG, Liang L, Wu WB, et al. Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum to enhance L-leucine production. Afri J Biotechnol, 2017, 16(18): 1048-1060. DOI:10.5897/AJB2017.15911

[60]

Schwentner A, Feith A, Münch E, et al. Metabolic engineering to guide evolution—Creating a novel mode for L-valine production with Corynebacterium glutamicum. Metab Eng, 2018, 47: 31-41. DOI:10.1016/j.ymben.2018.02.015

[61]

Mustafi N, Grünberger A, Mahr R, et al. Application of a genetically encoded biosensor for live cell imaging of L-valine production in pyruvate dehydrogenase complex-deficient Corynebacterium glutamicum strains. PLoS ONE, 2014, 9(1): e85731. DOI:10.1371/journal.pone.0085731

[62]

Gusyatiner MM, Lunts MG, Kozlov YI, et al. DNA coding for mutant isopropylmalate synthase, L-leucine-producing microorganism and method for producing L-leucine. US6403342 B1, 2002. https://www.freepatentsonline.com/6403342.html.

[63]

Wang YY, Zhang F, Xu JZ, et al. Improvement of L-leucine production in Corynebacterium glutamicum by altering the redox flux. Int J Mol Sci, 2019, 20(8): 2020. DOI:10.3390/ijms20082020

[64]

Kutukova EA, Livshits VA, Altman IP, et al. The yeaS (leuE) gene of Escherichia coli encodes an exporter of leucine, and the Lrp protein regulates its expression. FEBS Lett, 2005, 579(21): 4629-4634. DOI:10.1016/j.febslet.2005.07.031

[65]

Cusyatiner MM, Voroshilova EB, Rostova YG, et al. Method for producing L-leucine. US2004091980 B2, 2004. https://www.freepatentsonline.com/y2004/0091980.html.

[66]

Katashkina JY, Lunts MG, Doroshenko VG, et al. Method for producing an L-amino acid using a bacterium with an optimized level of gene expression. US7604979 B2, 2009. https://xueshu.baidu.com/usercenter/paper/show?paperid=950e6856800433162b27622d0bbdfa6b&site=xueshu_se&hitarticle=1.

[67]

Wang J, Wen B, Xu QY, et al. Optimization of carbon source and glucose feeding strategy for improvement of L-isoleucine production by Escherichia coli. Biotechnol Biotechnol Equip, 2015, 29(2): 374-380. DOI:10.1080/13102818.2015.1006899

[68]

Vogt M, Krumbach K, Bang WG, et al. The contest for precursors: channelling L-isoleucine synthesis in Corynebacterium glutamicum without byproduct formation. Appl Microbiol Biotechnol, 2015, 2(99): 791-800.

[69]

Wang J, Wen B, Wang J, et al. Enhancing L-isoleucine production by thrABC overexpression combined with alaT deletion in Corynebacterium glutamicum. Appl Biochem Biotechnol, 2013, 171(1): 20-30. DOI:10.1007/s12010-013-0321-0

[70]

Zhao JX, Hu XQ, Li Y, et al. Overexpression of ribosome elongation factor G and recycling factor increases L-isoleucine production in Corynebacterium glutamicum. Appl Microbiol Biotechnol, 2015, 99(11): 4795-4805. DOI:10.1007/s00253-015-6458-8

[71]

Ma WJ, Wang JL, Li Y, et al. Enhancing pentose phosphate pathway in Corynebacterium glutamicum to improve L-isoleucine production. Biotechnol Appl Biochem, 2016, 63(6): 877-885. DOI:10.1002/bab.1442

[72]

尹良鴻. 高產(chǎn)L-異亮氨酸谷氨酸棒桿菌的代謝工程改造. 無錫: 江南大學, 2013.
Yin LH. Metabolic engineering modifications of the L-isoleucine producing Corynebacterium glutamicum. Wuxi: Jiangnan University, 2013 (in Chinese).

[73]

徐慶陽, 孫家凱, 謝希賢, 等. 過表達hom基因?qū)劝彼岚魲U菌發(fā)酵L-異亮氨酸的影響. 天津科技大學學報, 2012, 27(5): 1-6.
Xu QY, Sun JK, Xie XX, et al. Effects of overexpression of homoserine dehydratase on L-isoleucine production in Corynebacterium glutamicum. J Tianjing Univ Sci Technol, 2012, 27(5): 1-6 (in Chinese).

[74]

Park JH, Jang YS, Lee JW, et al. Escherichia coli W as a new platform strain for the enhanced production of L-valine by systems metabolic engineering. Biotechnol Bioeng, 2011, 108(5): 1140-1147. DOI:10.1002/bit.23044

[75]

Blombach B, Arndt A, Auchter M, et al. L-valine production during growth of pyruvate dehydrogenase complex-deficient Corynebacterium glutamicum in the presence of ethanol or by inactivation of the transcriptional regulator SugR. Appl Environ Microbiol, 2009, 75(4): 1197-1200. DOI:10.1128/AEM.02351-08

[76]

Blombach B, Schreiner ME, Bartek T, et al. Corynebacterium glutamicum tailored for high-yield L-valine production. Appl Microbiol Biotechnol, 2008, 79(3): 471-479. DOI:10.1007/s00253-008-1444-z

[77]

Hasegawa S, Suda M, Uematsu K, et al. Engineering of Corynebacterium glutamicum for high-yield L-valine production under oxygen deprivation conditions. Appl Environ Microbiol, 2013, 79(4): 1250-1257. DOI:10.1128/AEM.02806-12

[78]

Hao GF, Chen HQ, Gu ZN, et al. Metabolic engineering of Mortierella alpina for enhanced arachidonic acid production through the NADPH-supplying strategy. Appl Environ Microbiol, 2016, 82(11): 3280-3288. DOI:10.1128/AEM.00572-16

[79]

Zheng B, Ma XY, Wang N, et al. Utilization of rare codon-rich markers for screening amino acid overproducers. Nature Communications, 2018, 9: 3616. DOI:10.1038/s41467-018-05830-0

[80]

Yakandawala N, Romeo T, Friesen AD, et al. Metabolic engineering of Escherichia coli to enhance phenylalanine production. Appl Microbiol Biotechnol, 2008, 78(2): 283-291. DOI:10.1007/s00253-007-1307-z

[81]

Liu LN, Duan XG, Wu J. Modulating the direction of carbon flow in Escherichia coli to improve L-tryptophan production by inactivating the global regulator FruR. J Biotechnol, 2016, 231: 141-148. DOI:10.1016/j.jbiotec.2016.06.008

[82]

Santos CNS, Xiao WH, Stephanopoulos G. Rational, combinatorial, and genomic approaches for engineering L-tyrosine production in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2012, 109(34): 13538-13543. DOI:10.1073/pnas.1206346109

[83]

Zhang CZ, Zhang JL, Kang Z, et al. Enhanced production of L-phenylalanine in Corynebacterium glutamicum due to the introduction of Escherichia coli wild-type gene aroH. J Ind Microbiol Biotechnol, 2013, 40(6): 643-651. DOI:10.1007/s10295-013-1262-x

[84]

Noda S, Kondo A. Recent advances in microbial production of aromatic chemicals and derivatives. Trends Biotechnol, 2017, 35(8): 785-796. DOI:10.1016/j.tibtech.2017.05.006

[85]

Gottlieb K, Albermann C, Sprenger GA. Improvement of L-phenylalanine production from glycerol by recombinant Escherichia coli strains: The role of extra copies of glpK, glpX, and tktA genes. Microb Cell Fact, 2014, 13: 96. DOI:10.1186/s12934-014-0096-1

[86]

Mascarenhas D, Ashworth DJ, Chen CS. Deletion of pgi alters tryptophan biosynthesis in a genetically engineered strain of Escherichia coli. Appl Environ Microbiol, 1991, 57(10): 2995-2999. DOI:10.1128/AEM.57.10.2995-2999.1991

[87]

Bongaerts J, Kr?mer M, Müller U, et al. Metabolic engineering for microbial production of aromatic amino acids and derived compounds. Metab Eng, 2001, 3(4): 289-300. DOI:10.1006/mben.2001.0196

[88]

Lütke-Eversloh T, Stephanopoulos G. L-tyrosine production by deregulated strains of Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol, 2007, 75(1): 103-110. DOI:10.1007/s00253-006-0792-9

[89]

Na D, Yoo SM, Chung H, et al. Metabolic engineering of Escherichia coli using synthetic small regulatory RNAs. Nat Biotechnol, 2013, 31(2): 170-174. DOI:10.1038/nbt.2461

[90]

Li GH, Chen ZC, Chen N, et al. Enhancing the efficiency of L-tyrosine by repeated batch fermentation. Bioengineered, 2020, 11(1): 852-861. DOI:10.1080/21655979.2020.1804177

[91]

Patnaik R, Zolandz RR, Green DA, et al. L-tyrosine production by recombinant Escherichia coli: fermentation optimization and recovery. Biotechnol Bioeng, 2008, 99(4): 741-752. DOI:10.1002/bit.21765

[92]

Xu S, Wang Q, Zeng WZ, et al. Construction of a heat-inducible Escherichia coli strain for efficient de novo biosynthesis of L-tyrosine. Proc Biochem, 2020, 92: 85-92. DOI:10.1016/j.procbio.2020.02.023

[93]

Zhang CZ, Zhang JL, Kang Z, et al. Rational engineering of multiple module pathways for the production of L-phenylalanine in Corynebacterium glutamicum. J Ind Microbiol Biotechnol, 2015, 42(5): 787-797. DOI:10.1007/s10295-015-1593-x

[94]

Liu SP, Xiao MR, Zhang L, et al. Production of L-phenylalanine from glucose by metabolic engineering of wild type Escherichia coli W3110. Proc Biochem, 2013, 48(3): 413-419. DOI:10.1016/j.procbio.2013.02.016

[95]

Gerigk MR, Maass D, Kreutzer A, et al. Enhanced pilot-scale fed-batch L-phenylalanine production with recombinant Escherichia coli by fully integrated reactive extraction. Bioprocess Biosyst Eng, 2002, 25(1): 43-52. DOI:10.1007/s00449-002-0280-2

[96]

Gerigk M, Bujnicki R, Ganpo-Nkwenkwa E, et al. Process control for enhanced L-phenylalanine production using different recombinant Escherichia coli strains. Biotechnol Bioeng, 2002, 80(7): 746-754. DOI:10.1002/bit.10428

[97]

Zhou HY, Liao XY, Wang TW, et al. Enhanced L-phenylalanine biosynthesis by co-expression of pheAfbr and aroFwt. Bioresour Technol, 2010, 101(11): 4151-4156. DOI:10.1016/j.biortech.2010.01.043

[98]

Zhou HY, Liao XY, Liu L, et al. Enhanced L-phenylalanine production by recombinant Escherichia coli BR-42 (pAP-B03) resistant to bacteriophage BP-1 via a two-stage feeding approach. J Ind Microbiol Biotechnol, 2011, 38(9): 1219-1227. DOI:10.1007/s10295-010-0900-9

[99]

Ding DQ, Liu YF, Xu YR, et al. Improving the production of L-phenylalanine by identifying key enzymes through multi-enzyme reaction system in vitro. Sci Rep, 2016, 6: 32208. DOI:10.1038/srep32208

[100]

Liu Q, Wang YP, Yao JY, et al. Impact resistance and static strength analysis of an extremely simplified micro hotplate with novel suspended film. Sensors Actuators A Phys, 2018, 280: 495-504. DOI:10.1016/j.sna.2018.08.003

[101]

Gu PF, Yang F, Li FF, et al. Knocking out analysis of tryptophan permeases in Escherichia coli for improving L-tryptophan production. Appl Microbiol Biotechnol, 2013, 97(15): 6677-6683. DOI:10.1007/s00253-013-4988-5

[102]

Liu Q, Cheng YS, Xie XX, et al. Modification of tryptophan transport system and its impact on production of L-tryptophan in Escherichia coli. Bioresour Technol, 2012, 114: 549-554. DOI:10.1016/j.biortech.2012.02.088

[103]

Chen YY, Liu YF, Ding DQ, et al. Rational design and analysis of an Escherichia coli strain for high-efficiency tryptophan production. J Ind Microbiol Biotechnol, 2018, 45(5): 357-367. DOI:10.1007/s10295-018-2020-x

[104]

Dodge TC, Gerstner JM. Optimization of the glucose feed rate profile for the production of tryptophan from recombinant E coli. J Chem Technol Biotechnol, 2002, 77(11): 1238-1245. DOI:10.1002/jctb.698

[105]

Liu LN, Duan XG, Wu J. L-tryptophan production in Escherichia coli improved by weakening the pta-AckA Pathway. Plos ONE, 2016, 11(6): e0158200. DOI:10.1371/journal.pone.0158200

[106]

Xu QY, Bai F, Chen N, et al. Gene modification of the acetate biosynthesis pathway in Escherichia coli and implementation of the cell recycling technology to increase L-tryptophan production. Plos ONE, 2017, 12(6): e0179240. DOI:10.1371/journal.pone.0179240

[107]

Wang J, Cheng LK, Wang J, et al. Genetic engineering of Escherichia coli to enhance production of L-tryptophan. Appl Microbiol Biotechnol, 2013, 97(17): 7587-7596. DOI:10.1007/s00253-013-5026-3

[108]

Cao MF, Gao MR, Suástegui M, et al. Building microbial factories for the production of aromatic amino acid pathway derivatives: From commodity chemicals to plant-sourced natural products. Metab Eng, 2020, 58: 94-132. DOI:10.1016/j.ymben.2019.08.008

[109]

Li MJ, Liu CQ, Yang JM, et al. Common problems associated with the microbial productions of aromatic compounds and corresponding metabolic engineering strategies. Biotechnol Adv, 2020, 41: 107548. DOI:10.1016/j.biotechadv.2020.107548

[110]

Chávez-Béjar MI, Báez-Viveros JL, Martínez A, et al. Biotechnological production of L-tyrosine and derived compounds. Process Biochemistry, 2012, 47(7): 1017-1026. DOI:10.1016/j.procbio.2012.04.005

[111]

Zhao ZJ, Chen S, Wu D, et al. Effect of gene knockouts of L-tryptophan uptake system on the production of L-tryptophan in Escherichia coli. Proc Biochem, 2012, 47(2): 340-344. DOI:10.1016/j.procbio.2011.11.009

[112]

Chen L, Chen ML, Ma CW, et al. Discovery of feed-forward regulation in L-tryptophan biosynthesis and its use in metabolic engineering of E. coli for efficient tryptophan bioproduction. Metab Eng, 2018, 47: 434-444. DOI:10.1016/j.ymben.2018.05.001

[113]

Li Z, Ding DQ, Wang HY, et al. Engineering Escherichia coli to improve tryptophan production via genetic manipulation of precursor and cofactor pathways. Synthd Syst Biotechnol, 2020, 5(3): 200-205. DOI:10.1016/j.synbio.2020.06.009

[114]

Wu HY, Tian DG, Fan XG, et al. Highly efficient production of L-histidine from glucose by metabolically engineered Escherichia coli. ACS Synth Biol, 2020, 9(7): 1813-1822. DOI:10.1021/acssynbio.0c00163

[115]

Zhang J, Qian FH, Dong F, et al. De novo engineering of Corynebacterium glutamicum for L-proline production. ACS Synth Biol, 2020, 9(7): 1897-1906. DOI:10.1021/acssynbio.0c00249

[116]

Mundhada H, Seoane JM, Schneider K, et al. Increased production of L-serine in Escherichia coli through adaptive laboratory evolution. Metab Eng, 2017, 39: 141-150. DOI:10.1016/j.ymben.2016.11.008

[117]

Rennig M, Mundhada H, Wordofa GG, et al. Industrializing a bacterial strain for L-serine production through translation initiation optimization. ACS Synth Biol, 2019, 8(10): 2347-2358. DOI:10.1021/acssynbio.9b00169

[118]

Ning YK, Wu XJ, Zhang CL, et al. Pathway construction and metabolic engineering for fermentative production of ectoine in Escherichia coli. Metab Eng, 2016, 36: 10-18. DOI:10.1016/j.ymben.2016.02.013

[119]

Solomon KV, Sanders TM, Prather KLJ. A dynamic metabolite valve for the control of central carbon metabolism. Metab Eng, 2012, 14(6): 661-671. DOI:10.1016/j.ymben.2012.08.006

[120]

Zhang CL, Li YJ, Zhu FZ, et al. Metabolic engineering of an auto-regulated Corynebacterium glutamicum chassis for biosynthesis of 5-aminolevulinic acid. Bioresour Technol, 2020, 318: 124064. DOI:10.1016/j.biortech.2020.124064

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