摘要

目的：探究前額葉高頻重復經(jīng)顱磁刺激（repetitive transcranial magnetic stimulation，rTMS）是否能提高健康大鼠認知功能，以及認知功能與運動皮質(zhì)長時程增強（long?term potentiation，LTP）樣可塑性的相關性。方法：24只SD健康成年大鼠，隨機分為control組和rTMS組（n =12），rTMS組接受為期4周的高頻（10 Hz）rTMS，control組接受4周假刺激。使用水迷宮檢測干預前后認知功能的改變；通過TMS結(jié)合肌電圖運動誘發(fā)電位（motor evoked potential，MEP）評價干預前后運動皮質(zhì)（M1區(qū)）LTP 樣可塑性的改變；通過Western blot檢測干預后大鼠M1區(qū)NR1、NR2A、NR2B的蛋白表達改變。結(jié)果：前額葉高頻rTMS可以提高健康大鼠空間情景記憶能力（P＜0.05）；前額葉高頻rTMS可以增強M1區(qū)可塑性，表現(xiàn)為M1區(qū)LTP樣可塑性增高及NR1和 NR2A蛋白表達上調(diào)（P＜0.05）；且M1區(qū)LTP樣可塑性的改變與空間情景記憶能力成正相關（P < 0.05）。結(jié)論：高頻rTMS可改善健康大鼠的空間情景記憶及運動皮質(zhì)LTP樣可塑性，且認知功能與運動皮質(zhì)LTP樣可塑性呈正相關。

Abstract

Objective：This study aims to investigate the contribution of M1 long ? term potentiation（LTP）? like plasticity to the improvement of cognitive function by high frequency repetitive transcranial magnetic stimulation at healthy rat’s head. Methods：A total of 24 rats were randomly divided into control group and rTMS group（n =12）. The cognitive function was detected by Morris water maze. The M1 plasticity was reflected by the motor ?evoked potential（MEP）before and after rTMS on the primary cortex（M1），the protein expressions of NR1，NR2A and NR2B in the M1 region of rats after high frequency rTMS were detected by Western blot. Results：After treatment，the spatial episodic memory and M1 plasticity showed significant improvement versus the control group（P＜ 0.05）. High?frequency rTMS in the prefrontal cortex can enhance the plasticity of the M1 region，which is characterized by increased LTP?like plasticity and up?regulated NR1 and NR2A protein expression in the M1 region. And the changes of LTP?like plasticity in M1 region were positively correlated with spatial episodic memory ability（P＜0.05）. Conclusion：High ?frequency rTMS could improve spatial episodic memory and cortical LTP ? like plasticity in healthy rats，and the improvement in spatial contextual memory was positively correlated with motor cortical plasticity.

經(jīng)顱磁刺激（transcranial magnetic stimulation， TMS）是一種神經(jīng)調(diào)控技術(shù)，它通過時變的脈沖磁場，在大腦皮質(zhì)內(nèi)產(chǎn)生感應電流，介導神經(jīng)元膜電位改變，從而影響神經(jīng)電生理活動和腦內(nèi)代謝[1]。重復經(jīng)顱磁刺激（repetitive TMS，rTMS）是TMS最常用的一種刺激方式，根據(jù)刺激參數(shù)的不同可產(chǎn)生不同的治療效應，其中高頻rTMS（頻率>1Hz）可以提高刺激區(qū)域皮質(zhì)的興奮性，產(chǎn)生突觸傳遞功能的長時程增強 （long?term potentiation，LTP）樣效應，并且能使刺激區(qū)域腦血流量增加，且通過被刺激腦區(qū)的神經(jīng)網(wǎng)絡連接可以影響到遠隔區(qū)域的大腦功能，產(chǎn)生遠隔效應[2-5]。

高頻rTMS在認知功能障礙的治療方面顯示出一定優(yōu)勢。近年來，大量臨床研究顯示以背外側(cè)前額葉皮質(zhì)為靶點的高頻rTMS可以改善正常人以及認知功能障礙患者的認知功能，但是其作用機制尚不清楚[6]。LTP和長時程抑制（long?term potiation， LTD）樣效應是大腦突觸可塑性的主要表現(xiàn)形式，與認知功能密切相關，可能是rTMS改變認知功能的主要原因[7]。體外研究發(fā)現(xiàn)，高頻rTMS可以通過介導突觸前膜和突觸后膜的同時去極化，導致突觸后膜N ?甲基?D?天冬氨酸受體（N?methyl?D?aspartic acid re? ceptor，NMDAR）鈣離子通道開放，大量快速鈣離子流入突觸后神經(jīng)元內(nèi)，從而誘發(fā)LTP效應[8-9]。體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)高頻rTMS可以增強皮層下LTP效應[10-13]。研究證明，阿爾茲海默癥（Alzheimer disease，AD）患者存在包括初級運動皮層（primary cortex，M1）在內(nèi)的廣泛皮質(zhì)可塑性受損，且其M1皮質(zhì)可塑性和認知功能正相關，可以輔助檢測及預測其認知功能[14]。TMS聯(lián)合肌電圖可以非侵入性的檢測M1區(qū)LTP樣可塑性，適用于臨床預測認知功能障礙患者的認知功能[14]。本研究擬探討高頻rTMS對健康大鼠大腦認知功能的影響及大腦運動皮質(zhì)LTP樣可塑性的改變，并分析運動皮質(zhì)LTP樣可塑性與認知功能改善的相關性。

1 材料和方法

1.1 材料

健康SPF級雄性成年SD大鼠24只，隨機分為control組和rTMS組（n=12），每組6只大鼠用于空間情景記憶檢測，之后進行M1區(qū)LTP樣可塑性檢測； 每組6只大鼠用于Westen blot檢測。大鼠體重350~400g[南京醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物許可證號：SYXK（蘇）2018?20020；動物實驗倫理號： 2007005?1]。所有動物均飼養(yǎng)于南京醫(yī)科大學SPF級實驗環(huán)境中，采用已消毒實驗動物飼料喂養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在20~25℃，自然光條件下自由攝食及飲水。嚴格按照中華人民共和國《實驗動物管理條例》進行實驗動物相關工作。

YRD CCY?IA型磁場刺激儀（武漢依瑞德），最大磁場強度為3.5T。 Morris水迷宮（北京吉安得爾科技有限公司），一抗anti?NMDAR 2B抗體（1∶1 000， 4207S，Cell Signal Technology公司，美國），anti?NM? DAR 2A抗體（1∶1 000，ab124913，Abcam公司，美國），anti?NMDAR1抗體（1∶1 000，5704S，Cell Signal Technology公司，美國），anti?β?actin抗體（1∶25 000， wx488142，ABclonal公司，美國），小鼠抗兔二抗（1∶ 5 000，sc ? 2357，Santa Cruz Blotechnology公司，美國），水合氯醛（C11597902，麥克林）。

1.2 方法

rTMS組所有大鼠均在清醒狀態(tài)下接受rTMS干預。使用依瑞德3號圓形動物線圈（外徑5.8cm，內(nèi)徑1.8cm）進行rTMS，線圈中點放于大鼠雙側(cè)內(nèi)眥連線中點，刺激頻率為10Hz，刺激強度為80%平均靜息運動閾值[10]，刺激10min，總共刺激1 000個脈沖，1d 1次，1周5次，共刺激4周。control組僅接受假刺激：將TMS線圈翻轉(zhuǎn)90°，垂直于大鼠頭皮，其余刺激參數(shù)與rTMS組一致。

記錄電極和參考電極的位置分別為大鼠右側(cè)腓腸肌肌腹和肌腱，地線電極置于大鼠脊柱旁肌肉，電極采用25G針電極。通過觸摸伸展的大鼠右側(cè)后肢確定肌肉位置。大鼠進入深度麻醉之后，在其左側(cè)M1區(qū)行單次TMS，記錄由磁刺激誘發(fā)出的肌電圖信號，肌電圖信號被放大×1 000，帶通濾波10~1 000Hz，采樣頻率為50Hz。

分別在rTMS組和對照隨機選出6只大鼠，進行RMT測量。10%水合氯醛麻醉（0.3mL/100g），深度麻醉后對大鼠左側(cè)M1區(qū)進行單脈沖TMS，同時采集右側(cè)腓腸肌的MEP，10次刺激中有5次能誘發(fā)MEP波幅超過50 μV的最小刺激強度為RMT。測得12只鼠的平均RMT為1.4T。

兩組大鼠，每組6只，在進行情景記憶檢測后對TMS響應（能得到運動誘發(fā)電位）的大鼠進行M1區(qū)LTP樣可塑性的檢測，10%水合氯醛麻醉（0.3mL/100g），大鼠進入深度麻醉狀態(tài)后在左側(cè)M1區(qū)給與刺激強度為120%RMT的TMS，同時記錄右側(cè)腓腸肌肌電圖，連續(xù)進行10次刺激，作為基線。基線測定后對M1區(qū)進行高頻rTMS干預，頻率為10Hz，串時程10s，串間歇5s，總時間10min，總脈沖數(shù)為1 000個，分別在刺激后0、10、15、30min這4個時間點采集運動誘發(fā)電位，分別采集10條。高頻rTMS干預前后MEP的波幅的增幅用于測定M1區(qū)的LTP樣可塑性。

采用Morris水迷宮進行空間情景記憶的檢測， Mirrois水迷宮的直徑1.5m、高0.5m、水深0.22m，共分為NE、NW、SE、SW 4個象限，實驗時水池溫度控制在22~24℃，實驗過程中保持安靜。兩組大鼠，每組6只進行情景記憶的檢測，歷時5d。實驗分為定位航行和空間探索階段，在定位航行階段，將固定平臺放于SE象限正中，隱藏于被黑墨水染色的水下2cm處，將大鼠依次從4個象限面壁放入水中，記錄其找到平臺的時間，記為逃避潛伏期。第5天為探索階段，將平臺從水池中取出，并將大鼠從NW象限放入，記錄其在60s內(nèi)在平臺所在象限探索的時間，以及穿過平臺的次數(shù)。

大鼠在進行rTMS治療后立即行乙醚麻醉，并斷頭處死，取雙側(cè)M1區(qū)組織，RIPA中度裂解液中剪碎勻漿提取組織蛋白，經(jīng)BCA試劑盒蛋白定量后，加入DTT（7 μL/100 μL）和上樣緩沖液，渦旋儀混勻后煮沸，冷卻至室溫，在-20℃冰箱中保存。SDS ? PAGE凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，之后封閉2h。將膜取出，加入一抗，4°孵育過夜；TBST洗膜10min×3次；將膜轉(zhuǎn)入二抗孵育2h；用化學發(fā)光法顯色、曝光、顯影定影。所得條帶使用Image J圖像分析軟件分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

在統(tǒng)計分析中數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準誤（standard error，SEM）來表示。M1區(qū)LTP樣改變和空間情景記憶均用SPSS 22.0軟件進行重復測量的方差分析， Mauchly檢驗是否滿足球形假設，有交互作用時分析各因素的單獨效應，無交互作用時，分析各效應的主效應；運用Spearman相關分析M1皮層LTP樣改變和空間情景記憶之間的相關性，獨立樣本t檢驗分析干預后NR1、NR2A及NR2B的蛋白表達水平，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 空間情景記憶

干預前control組和rTMS組空間情景記憶無統(tǒng)計學差異（P> 0.05，圖1A、D、G），4周rTMS干預后，統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)定位航行階段（0~4d）每天的平均逃避潛伏期經(jīng)重復測量的方差分析并未有交互效應 （F=0.820，P ＞0.05），遂對各個時間點采用單因素方差分析。干預前后control組和rTMS組大鼠游泳速度的差異均不具有統(tǒng)計學意義（P ＞0.05，圖1C）。在水迷宮的定位航行階段（0~4d）時，control組和rTMS組平均逃避潛伏期的差異不具有統(tǒng)計學意義 （P ＞0.05，圖1B）。在空間探索階段（第5天）時，與control組相比，rTMS組穿過平臺的次數(shù)增加，且具有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05，圖1H），但探索的時間增加不明顯（P ＞0.05，圖1E），證明前額葉高頻rTMS可以改善健康大鼠的空間情景記憶。

2.2 健康大鼠M1區(qū)LTP樣改變

干預前control組和rTMS組的M1區(qū)LTP樣改變無統(tǒng)計學差異（P> 0.05，圖2A）；干預后，與control組相比rTMS組M1區(qū)LTP樣改變增強，且具有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05，圖2B）。

2.3 健康大鼠M1區(qū)LTP樣改變與認知功能相關性分析

4周rTMS干預前、后M1區(qū)0min的LTP樣改變與其空間情景記憶正相關，且具有統(tǒng)計學意義（P< 0.05，圖3A、B）。

2.4 M1區(qū)NR1、NR2A、NR2B蛋白的表達

4周高頻rTMS干預后，與control組相比rTMS組M1區(qū)NR1和NR2A蛋白表達上調(diào)（P＜0.05、P ＜ 0.01，圖4A、B），但是兩組NR2B的表達差異不具有統(tǒng)計學意義（P ＞0.05，圖4A、B）。

3 討論

可塑性是根據(jù)外界刺激或一段時間的訓練學習重建神經(jīng)之間的信號連接，它是大腦實現(xiàn)自身重建的能力。神經(jīng)系統(tǒng)可塑性的功能性改變，包括突觸間分子水平的改變、突觸膜上的改變、神經(jīng)元水平的改變以及神經(jīng)網(wǎng)絡間信號傳遞過程改變四個水平[15-16]。 LTP效應表示突觸之間的連接強度增強，其與學習和記憶密切相關，而LTD則與LTP相反，與神經(jīng)元死亡和突觸之間的連接強度下降有關[16]。研究發(fā)現(xiàn)藥物或基因修飾阻斷LTP，會造成記憶和學習能力的嚴重缺陷，但通過一段時間的學習訓練可以增強大腦LTP[16]。研究表明AD患者存在M1皮質(zhì)LTP樣可塑性損害，且認知功能和LTP樣可塑性正相關，因此LTP樣可塑性可以用于預測AD患者認知功能[14]。

皮質(zhì)可塑性已經(jīng)成為近年來非侵入性治療認知功能障礙的重要靶點，已有研究發(fā)現(xiàn)作用于前額葉的高頻rTMS可以改善AD患者的認知功能，且發(fā)現(xiàn)M1皮質(zhì)可塑性改善和認知功能正相關[14]。功能核磁共振的研究發(fā)現(xiàn)，以背外側(cè)前額葉為靶點的高頻rTMS不僅可以激活背外側(cè)前額葉，還可以激活包括海馬區(qū)、下丘腦、小腦在內(nèi)的其他腦區(qū)，產(chǎn)生遠隔效應，改善認知功能[2-5]。本研究發(fā)現(xiàn)前額葉高頻rTMS治療4周后，健康大鼠空間情景記憶能力和M1區(qū)LTP樣可塑性改善，且認知功能的改善和M1皮質(zhì)可塑性正相關。同時本研究發(fā)現(xiàn)rTMS干預后M1區(qū)NMDAR亞基NR1和NR2A表達上調(diào)。NMDAR依賴的LTP是大腦中LTP的主要模式，NMDAR表達上調(diào)介導LTP效應的增強，NMDAR是NMDAR依賴LTP效應的“開關”，其開放條件是突觸后膜去極化的基礎上結(jié)合谷氨酸以及D?絲氨酸或甘氨酸[2-5]。 NMDAR在突觸后膜的表達上調(diào)是LTP樣可塑性增強的主要表現(xiàn)[17]。本研究發(fā)現(xiàn)前額葉高頻rTMS治療4周后M1區(qū)NR1和NR2A的蛋白表達上調(diào)，從分子機制證明了高頻rTMS可以通過上調(diào)突觸上NMDAR，改善皮質(zhì)LTP樣可塑性。本研究結(jié)果在M1區(qū)發(fā)現(xiàn)了皮質(zhì)LTP樣可塑性的提高，支持高頻rTMS的作用并不僅僅局限于干預靶點所在的腦區(qū)，還可以通過腦網(wǎng)絡連接產(chǎn)生遠隔效應?？紤]到NMDAR 2B主要分布在突觸外，rTMS介導的LTP效應主要在突觸水平，這可能本研究中rTMS干預后NMDAR 2B并未表達上調(diào)的原因。

Fig.1 Water mazes test spatial episodic memory

Fig.2 Changes in LTP?like plasticity in the M1region

Fig.3 Correlation between spatial episodic memory and LTP?like changes in M1region

圖4 Western blot檢測M1區(qū)NR1、NR2A和NR2B蛋白表達改變

Fig.4 Protein expression changes of NR1，NR2A and NR2B in M1region

動物實驗證明，AD可以導致大腦廣泛性損害。研究發(fā)現(xiàn)4.0~4.5月齡APP/PS1小鼠出現(xiàn)M1區(qū)、內(nèi)側(cè)前額葉以及海馬區(qū)LTP損害，并開始出現(xiàn)情景記憶的損害[18]。同時臨床研究證明，AD早期患者M1區(qū)LTP樣可塑性受損，且獨立于發(fā)病年齡，和認知受損密切相關[19]。另外，一項4年的前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，M1區(qū)LTP樣可塑性可以預測輕度認知障礙患者認知下降的進程，即M1區(qū)LTP樣可塑性較好的患者發(fā)展為AD的概率更小[20]。TMS結(jié)合肌電圖評估M1區(qū)可塑性目前已在臨床廣泛應用，本研究通過行為學和神經(jīng)電生理評估發(fā)現(xiàn)健康大鼠干預后的認知功能與運動皮質(zhì)LTP樣可塑性呈正相關，并從分子機制加以證明，為使用M1區(qū)皮質(zhì)LTP樣可塑性來評估認知功能提供了理論支撐。

然而本研究仍然存在局限性。首先，在進行M1區(qū)LTP樣可塑性檢測時，使用了水合氯醛作為麻醉劑，麻醉狀態(tài)會影響LTP樣可塑性的檢測，所以本研究為了保證均一性，兩組大鼠均在深度麻醉狀態(tài)后進行LTP樣可塑性的檢測。第二，本研究采用的是直徑為5.8cm的圓形線圈，而大鼠頭部體積相對較小，使得本研究與相關的人類實驗存在差異，但是目前并未有直徑和大鼠頭部體積匹配的動物線圈。第三，認知功能相關的腦區(qū)很多，因此對于認知功能的rTMS干預可能還存在其他有效靶點，而本研究未設立以其他腦區(qū)作為刺激靶點的對照，因此無法比較rTMS在不同腦區(qū)的作用差異。最后，本研究未從細胞水平檢測M1區(qū)LTP樣可塑性，未來將進行形態(tài)學分析，以提供更多維度的證據(jù)。

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網(wǎng)址: 高頻rTMS對健康大鼠認知功能與運動皮質(zhì)LTP變化的相關性研究 http://www.gysdgmq.cn/newsview336495.html