銅是人體必需的微量元素，為人體許多代謝關(guān)鍵酶的重要組成成分，如：Cu/Zn超氧化物歧化酶1（SOD1）、細胞色素C氧化酶（CCO）、賴氨酰氧化酶（LOX），人體在細胞和分子水平上的銅代謝過程見圖1。因具有兩種離子狀態(tài)，所以其在機體氧化還原反應中是重要的輔助因子。2022年3月研究人員新發(fā)現(xiàn)一種銅依賴性細胞死亡方式：銅死亡（cuprotosis）［1］，該發(fā)現(xiàn)進一步強調(diào)人體對銅穩(wěn)態(tài)機制的需求。人體銅水平處于動態(tài)平衡，無論遺傳性還是獲得性銅穩(wěn)態(tài)失調(diào)均會導致或加重某些疾病，如Menkes病、Wilson?。╓D）、癌癥等。近年來隨著研究的不斷深入，研究人員發(fā)現(xiàn)銅穩(wěn)態(tài)失衡會通過多種途徑促進細胞損傷并與多種肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［2－3］。本文總結(jié)近年來有關(guān)研究結(jié)果，為未來肝臟疾病診療提供新思路。

圖1  肝細胞的銅穩(wěn)態(tài)機制       

1銅穩(wěn)態(tài)失衡促進細胞損傷機制

1.1.   銅和氧化應激

活性氧（ROS）是人體細胞代謝副產(chǎn)物，高濃度的ROS可引起細胞結(jié)構(gòu)與功能損傷、增加細胞癌變的風險、誘導細胞死亡的發(fā)生［4］。生理狀態(tài)下胞內(nèi)銅處于一種動態(tài)平衡，銅水平過高或過低均可使細胞發(fā)生氧化應激。

1.1.1.   細胞內(nèi)銅超負荷導致氧化應激發(fā)生

銅超負荷時可通過Fenton反應產(chǎn)生大量ROS，降低胞內(nèi)還原型谷胱甘肽（GSH）含量，導致細胞對有害刺激敏感性升高。有研究［5］表明胞內(nèi)銅超負荷通過誘發(fā)氧化應激，導致線粒體膜通透性改變、DNA損傷、促凋亡蛋白表達增加［如B細胞淋巴瘤－2基因的相關(guān)X蛋白（BAX）、半胱天冬酶－3、9］，進而誘發(fā)細胞凋亡的發(fā)生。

1.1.2.   細胞內(nèi)銅缺乏導致氧化應激發(fā)生

人體存在多種銅依賴性抗氧化酶（如：SOD1、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶），銅缺乏導致上述銅酶活性降低，胞內(nèi)ROS蓄積誘導氧化應激的發(fā)生。SOD1突變是肌萎縮性側(cè)索硬化癥的重要遺傳病因，研究證實神經(jīng)元細胞內(nèi)銅缺乏通過增加突變的SOD1錯誤折疊和改變其疏水性導致神經(jīng)細胞損傷和死亡的發(fā)生，而口服銅絡合物可明顯減少小鼠脊髓內(nèi)的運動神經(jīng)元死亡數(shù)量［6］。

1.2.   銅與蛋白酶體

研究表明腫瘤細胞內(nèi)蛋白酶體活性明顯增加，通過降解細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（如P21和P27）、腫瘤抑制因子（如P53）、細胞凋亡抑制因子和細胞凋亡調(diào)節(jié)因子（如BAX）等促進腫瘤生長。2020年Ga?czyńska等［7］研究證實蛋白酶體抑制劑通過促進細胞色素C進入細胞質(zhì)基質(zhì)，結(jié)合并激活凋亡蛋白酶激活因子1和前體半胱天冬酶－9，導致細胞凋亡的發(fā)生。而胞內(nèi)銅超負荷可通過誘導氧化應激介導26S蛋白酶體的分解進而抑制胞內(nèi)蛋白酶體活性［8］。

1.3.   銅死亡

2022年Tsvetkov等［1］在人類細胞中發(fā)現(xiàn)一種不同于已知的細胞死亡方式：銅死亡，這是一種由線粒體銅的靶向積累引發(fā)的新形式的細胞死亡，下文將從三個方面簡述銅死亡發(fā)生機制。

1.3.1.   銅代謝紊亂

銅離子載體可以打破人體細胞內(nèi)銅的動態(tài)平衡［1］，用銅離子載體（如：伊利司莫）處理后胞內(nèi)銅水平升高，過多的銅與脂?；鞍椎牧蛐粱糠纸Y(jié)合誘發(fā)脂?；鞍拙奂?，導致細胞銅死亡的發(fā)生，而銅螯合劑、鐵氧還蛋白1（銅離子載體伊利司莫作用靶點）［9］和硫辛基合成酶基因敲除可以降低細胞發(fā)生銅死亡的風險。

1.3.2.   三羧酸循環(huán)脂酰蛋白功能紊亂

脂?；鞍拙奂倾~死亡發(fā)生的關(guān)鍵，已知蛋白脂酰化僅發(fā)生在三羧酸循環(huán)中的四種關(guān)鍵酶，丙酮酸脫氫酶復合體的E2亞基二氫硫辛酸轉(zhuǎn)乙酰化酶（DLAT）正是其中之一。銅超負荷引起DLAT的聚集、Fe－S簇蛋白水平降低、熱休克蛋白70數(shù)量增加、蛋白質(zhì)毒性應激，從而導致銅死亡的發(fā)生。

1.3.3.   線粒體有氧呼吸調(diào)節(jié)銅死亡

線粒體有氧呼吸在銅死亡的發(fā)生中起重要調(diào)節(jié)作用［1］，實驗證實在缺氧條件下（1% O2）生長的細胞不易發(fā)生銅死亡。使用低氧誘導因子（HIF－1）分解關(guān)鍵酶脯氨酸羥化酶抑制劑處理常氧條件下（21% O2）生長的細胞，其銅死亡發(fā)生率未見明顯改變。Tsvetkov等［1］也通過抑制細胞線粒體呼吸證實線粒體有氧呼吸在銅死亡中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。

1.4.   銅與血管形成

人體血管生成是血管內(nèi)皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子、IL－1、IL－6、IL－8等多種小分子綜合作用的結(jié)果［10］。有研究［11］表明，銅可通過與血管生成素直接結(jié)合或結(jié)合HIF－1后激活上述小分子進而刺激血管生成。此外銅還可通過促進血管內(nèi)皮增殖及遷移、細胞外基質(zhì)降解以促進血管生成，胞內(nèi)銅降低可抑制血管生成，切斷組織的營養(yǎng)供應，導致細胞發(fā)生損傷和死亡。

1.5.   銅與細胞凋亡、自噬、鐵死亡

X連鎖細胞凋亡抑制蛋白（XIAP）可結(jié)合并抑制半胱天冬酶3、7和9的活性進而調(diào)節(jié)細胞凋亡的發(fā)生［12］。XIAP具有很強的銅親和力，與銅可逆性結(jié)合后極易發(fā)生泛素化蛋白酶體降解同時喪失抑制細胞凋亡能力，進而降低細胞凋亡的發(fā)生閾值。XIAP可通過介導銅代謝MURR1結(jié)構(gòu)域1（COMMD1）的泛素化蛋白酶體降解調(diào)節(jié)細胞銅水平，銅超負荷可降低胞內(nèi)XIAP水平，導致COMMD1的水平升高，促進銅從細胞流出［13］。

研究發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)異常升高的銅可激活自噬相關(guān)的絲氨酸/蘇氨酸激酶Unc51樣自噬激活激酶1和2（ULK1、2）依賴性信號轉(zhuǎn)導通路誘導細胞發(fā)生自噬。Yang等［14］研究發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)銅超負荷可促進胞內(nèi)自噬相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而抑制銅誘導細胞凋亡的發(fā)生。有研究證實ATP7B敲除細胞內(nèi)自噬相關(guān)基因表達水平明顯上調(diào)［15］，Polishchuk等［16］同樣發(fā)現(xiàn)在WD患者及ATP7B缺乏小鼠肝細胞內(nèi)過量的銅通過Cu－mTORC1－TFEB信號轉(zhuǎn)導提高胞內(nèi)自噬水平，抑制自噬可明顯加速細胞凋亡的發(fā)生。

既往研究發(fā)現(xiàn)鐵死亡在雙硫侖－Cu的抗腫瘤作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用，Gao等［17］用伊利司莫處理細胞使胞內(nèi)線粒體銅水平升高，誘導氧化應激與鐵死亡的發(fā)生。有趣的是，Li等［18］研究證實細胞銅耗竭通過降低胞內(nèi)GSH含量及抑制谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）活性，也可促進細胞鐵死亡的發(fā)生，從而建立了銅耗竭與鐵死亡的直接聯(lián)系。除上述的直接聯(lián)系，Guo等［19］發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)銅超負荷通過ROS依賴性AMPK－mTOR途徑誘導自噬進而抑制細胞凋亡的發(fā)生，而自噬水平升高反過來通過抑制GPX4和降解FTH1等鐵蛋白促進細胞鐵死亡的發(fā)生。但也有研究［20－21］表明肝細胞癌（HCC）細胞內(nèi)銅超負荷，一方面促進銅藍蛋白（CP）合成降低胞內(nèi)鐵水平，其次通過Cu－HIF1α－SLC7A11（GSH合成關(guān)鍵蛋白）途徑促進GSH合成，進而抑制胞內(nèi)鐵死亡的發(fā)生。

線粒體損傷在WD發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，Zischka等［22］發(fā)現(xiàn)在WD早期，隨著肝銅水平升高引起線粒體漸進式結(jié)構(gòu)損傷，而這早于氧化應激的發(fā)生。胞內(nèi)銅水平升高及線粒體損傷均可誘導線粒體選擇性自噬的發(fā)生，以減少銅毒性及抑制線粒體介導的細胞凋亡發(fā)生。線粒體為銅死亡發(fā)生的核心，線粒體選擇性自噬極可能抑制銅死亡的發(fā)生，而自噬與銅死亡的關(guān)系仍需要進一步研究證實（圖2）。

圖2  銅缺乏或超載促進細胞損傷的機制示意圖    

2銅穩(wěn)態(tài)失衡與肝病的關(guān)系

2.1.   銅與WD

WD是一種常染色體隱性遺傳病，由銅轉(zhuǎn)運P型ATP酶（ATP7B）先天突變導致銅在肝臟及其他組織中累積［2］，進而引發(fā)一系列病變。

近年來研究發(fā)現(xiàn)WD患者過量肝銅通過抑制核受體功能、導致線粒體功能障礙等引發(fā)WD的肝臟病變。核受體參與調(diào)節(jié)細胞基因表達，WD患者異常升高的銅通過抑制核受體進而影響細胞脂質(zhì)代謝。肝臟X受體（LXR）是WD早期銅作用的主要靶點之一，Hamilton等［23］單獨使用LXR激動劑T0901317治療ATP7B缺陷小鼠，結(jié)果顯示肝纖維化和炎性細胞因子顯著降低，肝功能和組織學得到改善。以往觀點認為WD患者異常升高的肝銅主要通過誘發(fā)氧化應激導致線粒體功能障礙，但近年來研究發(fā)現(xiàn)在肝銅介導的氧化應激發(fā)生之前，線粒體銅較正常水平升高約200倍，引起線粒體內(nèi)外膜交聯(lián)、線粒體膜電位變化、ATP產(chǎn)生減少和抑制線粒體DNA復制［22，24－25］，從而導致線粒體結(jié)構(gòu)、功能障礙和細胞凋亡的發(fā)生。

更早診斷及開始銅螯合治療可以明顯改善WD患者預后及預防神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的發(fā)生，現(xiàn)有的診斷方法早期診斷WD比較困難，這就要求尋找新的診斷方法及生物標志物。近年來有研究發(fā)現(xiàn)血液相對可交換銅和ATP7B肽濃度在診斷WD中具有高敏感性和特異性，但實際應用需要進一步驗證。

口服銅螯合劑和鋅是WD患者一線治療方法，長期口服的不良反應、神經(jīng)系統(tǒng)癥狀惡化仍是WD治療所面臨的挑戰(zhàn)，而肝細胞及線粒體導向銅螯合劑的研究有望改善這一困境?；謴虯TP7B定位、功能的靶向分子療法及基因治療也在積極研發(fā)中［2，25］。銅可通過多種途徑促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但有證據(jù)表明WD患者肝臟惡性腫瘤發(fā)病率遠低于其他病因［26－27］，研究人員推測這可能與WD患者長期口服銅螯合劑掩蓋了肝銅的“自然”分布相關(guān)［26］。但也有證據(jù)表明過量銅攝入可以抑制大鼠化學毒物誘導細胞癌變，而長期口服銅螯合劑導致肝鐵積聚和隨后對肝細胞的傷害，可能是長期口服銅螯合劑WD患者發(fā)生HCC的一個原因。總之，HCC是WD患者的一種罕見并發(fā)癥，闡述這種關(guān)聯(lián)有助于WD患者肝臟惡性腫瘤的早期診斷和管理。

2.2.   銅與非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）

NAFLD是一組以肝臟中脂肪堆積為特征的疾病，包括非酒精性脂肪肝（NAFL）和非酒精性脂肪性肝炎（NASH），最終可導致肝硬化和HCC，流行病學調(diào)查顯示全球NAFLD患病率約為25%，已成為最常見的慢性肝病［28］。有證據(jù)表明，銅穩(wěn)態(tài)失衡與NAFLD的發(fā)病密切相關(guān)，既往研究［29］發(fā)現(xiàn)NAFLD動物模型的肝銅水平降低，同時成人和兒童NAFLD患者的血清、肝臟和頭發(fā)中的銅水平均較對照組降低。Tosco等［30］對銅缺乏大鼠的研究強調(diào)胞內(nèi)銅水平降低通過損傷細胞線粒體形態(tài)和功能，抑制游離脂肪酸β氧化，促進肝細胞脂肪變性。果糖通過抑制十二指腸CTR－1表達減少銅的吸收，Song等［31］實驗發(fā)現(xiàn)高果糖飲食小鼠的血清銅及肝銅水平降低，而低銅會顯著抑制細胞脂肪酸β氧化限速酶肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶及上調(diào)細胞脂肪酸合成關(guān)鍵酶脂肪酸合成酶（FAS）的表達，誘發(fā)小鼠肝臟脂肪變性及肝細胞損傷。

研究［32］表明，銅攝入不足可能與NAFLD有關(guān)。Tallino等［33］發(fā)現(xiàn)低銅和高蔗糖飲食會明顯上調(diào)與肝臟炎癥、纖維生成和FAS相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄和表達，在沒有嚴重肥胖的情況下，誘導肝臟脂肪變性和損傷的發(fā)生。肝銅降低通過抑制CP的活性和肝臟鐵轉(zhuǎn)運蛋白的表達減少肝鐵輸出，Aigner等［32］通過肝臟活檢顯示NAFLD患者的肝鐵含量增加，而鐵超負荷也通過誘導氧化應激、胰島素抵抗和肝臟炎癥來促進NAFLD發(fā)展，這些因素在NAFLD的發(fā)生和發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。

與上述結(jié)果相矛盾的是，許多肝病的流行病學特征、疾病進展和治療策略存在性別相關(guān)差異［34］。最近的一項研究也表明，血銅水平與NAFLD之間的關(guān)系僅在男性患者中顯著［35］，這可能與雌性激素的保護作用及銅攝入量存在性別差異相關(guān)。St?ttermayer等［36］發(fā)現(xiàn)僅在無代謝綜合征的NAFLD患者中，肝銅水平和肝脂肪變性程度之間存在負相關(guān)，這一結(jié)果與Lan等［35］的發(fā)現(xiàn)相反，這種差異可能是作者在實驗中未考慮性別因素。此外，Aigner等［32］發(fā)現(xiàn)相比NAFL，NASH患者的肝銅含量更低，這表明肝銅水平與NAFL/NASH的進展相關(guān)。然而，也有證據(jù)表明NAFLD進展至肝硬化階段，肝銅水平明顯升高，具體原因尚未可知［37］。這些矛盾的結(jié)果提示銅與NAFLD之間具有更為復雜的聯(lián)系，在未來需要進一步研究闡述銅在NAFLD發(fā)生、發(fā)展中的作用。

2.3.   銅與HCC

HCC是肝臟最常見的惡性腫瘤，是世界腫瘤相關(guān)性死亡第四大原因［38］。有證據(jù)表明HCC患者血清及肝銅水平升高［39］，而這種現(xiàn)象可能與HCC細胞ATP7B下調(diào)或大型胞飲作用密切相關(guān)，同時Davis等［40］也發(fā)現(xiàn)敲除HCC細胞CTR－1基因可明顯抑制腫瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移。研究表明銅可通過多種機制促進腫瘤形成，具體機制尚未完全闡明，但研究人員使用銅處理HCC細胞顯示可增強其增殖和遷移能力。大多數(shù)HCC細胞MYC明顯過表達，2018年P(guān)orcu等［41］發(fā)現(xiàn)HepaRG細胞中過表達的MYC和MYC關(guān)聯(lián)因子X結(jié)合后，與CTR－1基因啟動子結(jié)合并誘導其轉(zhuǎn)錄，通過提高胞內(nèi)銅水平促進腫瘤細胞增殖和遷移。

LOX家族是銅依賴性賴氨酰氧化酶，人HCC組織中LOX表達水平明顯升高，研究表明LOX家族通過TGF－β介導的P38MAPK－VEGF信號轉(zhuǎn)導促進血管形成，通過H1F－1/LOX信號轉(zhuǎn)導通路使得細胞外基質(zhì)膠原蛋白相互交聯(lián)，促進HCC細胞生長與轉(zhuǎn)移［42］。同時HCC組織中LOXL－2水平與HCC患者總體生存期和疾病特異性生存期呈負相關(guān)［43］。四硫鉬酸鹽（TTM）已被證明可通過影響LOX活性來抑制細胞增殖和頭頸部鱗狀細胞癌的骨破壞行為，但其在HCC中的應用未來仍需進一步研究［44］。

COMMD蛋白家族在銅代謝中起關(guān)鍵作用，COMMD1缺乏引起細胞ATP7B從胞質(zhì)囊泡到胞質(zhì)膜運輸缺陷，肝銅排出受阻導致肝內(nèi)銅水平異常升高［45］。2022年Yang等［20］研究發(fā)現(xiàn)COMMOD10通過改變胞內(nèi)Cu/Fe平衡和HIF－1/CP通路來影響HCC細胞放射抵抗性和鐵死亡的發(fā)生，因此銅螯合劑TEPA可作為HCC患者的潛在放療致敏劑。

HCC細胞中異常銅穩(wěn)態(tài)為其診斷和治療提供了一個新的方向［40］，Yoshii等［46］研究發(fā)現(xiàn)曲恩?。ㄒ环N銅螯合劑）可通過抑制內(nèi)皮細胞增殖和誘導細胞凋亡顯著抑制HCC的生長和血管生成。HCC細胞內(nèi)因糖酵解增強導致乳酸含量上升，進而通過乳酸/NF－κB/IL－8軸促進腫瘤血管生成，而這也與經(jīng)導管肝動脈栓塞術(shù)/肝動脈灌注化療栓塞術(shù)（TAE/TACE）術(shù)后腫瘤快速復發(fā)相關(guān)。2020年Davis等［40］證實銅與HCC細胞在缺氧條件下代謝重編程密切相關(guān)，TTM螯合HCC胞內(nèi)銅后可降低HCC糖酵解水平，進而抑制腫瘤細胞增殖活性，而TTM與TAE/TACE聯(lián)合治療HCC的療效也尚待進一步研究。肝臟負責吸收和代謝含有金屬的復合物，Rezaei等［47］發(fā)現(xiàn)Cu（Ⅱ）復合物通過上調(diào)HepG2細胞抑癌基因P53和凋亡基因（BAX和半胱天冬酶－8）的表達以及下調(diào)抗凋亡基因BCL－2的表達，誘導細胞發(fā)生凋亡，同時一些新型銅復合物也被開發(fā)用于HCC的光動力治療。

一項來自我國廣東的臨床研究［48］發(fā)現(xiàn)，HCC患者血清銅水平與肝癌特異性生存期和總體生存期顯著相關(guān)，這表明循環(huán)銅水平可能是HCC生存期的獨立預測因子。與原發(fā)性HCC相反，轉(zhuǎn)移HCC細胞銅攝取增加，因此64Cucl2－PET－CT可用于非侵入性評估位于生理銅攝取低區(qū)域的HCC的顱內(nèi)轉(zhuǎn)移和其他肝外轉(zhuǎn)移，可用于肝移植患者術(shù)前評估，對改善轉(zhuǎn)移性HCC患者的預后具有重要意義。此外放射性銅同位素也可作為放射性藥物用于HCC肝外轉(zhuǎn)移的治療。       

3展望

最近的研究揭示了銅代謝的分子機制及其在人類疾病中的作用，銅死亡的發(fā)現(xiàn)為疾病機制的研究以及診斷和治療方式的改進提供了新的思路和期望，銅螯合劑和銅補充劑也已被廣泛用于銅代謝引起的疾病中。近年來銅代謝失調(diào)與肝臟疾病之間的關(guān)系已被充分證實，除了WD、NAFLD和HCC等肝臟疾病外，還有一些證據(jù)表明酒精攝入［49］和HCV感染［50］可能會影響人類的銅代謝調(diào)節(jié)，未來進一步探索銅代謝與慢性病毒性肝病和非病毒性肝病之間的關(guān)系，將為闡明這些疾病的發(fā)病機制和尋找新的治療目標提供理論證據(jù)。  

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