藥苑雜談 YAOYUANZATAN
注射劑是直接注射到人體器官、組織或血液的無菌產(chǎn)品，中國藥典規(guī)定注射劑中不得含有任何活的微生物，因此生產(chǎn)過程中的微生物控制至關重要。細菌內毒素是微生物、主要是革蘭氏陰性菌釋放的復合物，除無菌這一重要控制項外，還應對注射劑進行細菌內毒素檢測，合理控制細菌內毒素水平對注射劑安全性有重要意義。
本文將對細菌內毒素的產(chǎn)生、去除、檢測及最新研究內容進行講解。
一、細菌內毒素的產(chǎn)生與危害
細菌內毒素的本質是磷脂多糖和蛋白質復合物，主要存在于革蘭氏陰性菌的細胞壁中，在細菌死亡或處于應激狀態(tài)時會大量釋放。由其引發(fā)的毒性反應主要包括發(fā)熱反應、白細胞反應、內毒素休克。
曾經(jīng)轟動一時的青霉素導致患者死亡事件，使得公眾對細菌內毒素的認識更加深刻。
事情是這樣的，青霉素問世后，有研究者發(fā)現(xiàn)青霉素對流行性腦膜炎有非常顯著的療效，青霉素立即成為當時流行性腦膜炎的首選藥物，按照一般規(guī)律，用藥劑量會隨著病人病情的嚴重情況做出調整，但是在大劑量使用青霉素時卻發(fā)生了患者用藥后休克然后死亡的狀況。原因是流行性腦膜炎的病原菌屬于革蘭氏陰性菌，青霉素一舉殲滅腦膜炎奈瑟菌的同時，細菌內毒素因菌體死亡、包膜破裂而大量釋放，造成患者發(fā)生內毒素休克，最終死亡。
細菌內毒素具有廣泛的生物活性，極微量就可使人體產(chǎn)生發(fā)熱、過敏甚至休克反應。由于細菌內毒素引發(fā)的生理學反應對人體健康危害嚴重，目前藥品、食品、醫(yī)療器械和臨床領域均對細菌內毒素進行嚴格控制。
二、細菌內毒素去除方法
細菌內毒素具有體積小、耐高溫的特點，通過普通的除菌過濾和濕熱滅菌難以清除，經(jīng)過常規(guī)生產(chǎn)條件后在人體自然條件下仍然保持活性，因此首先就要從生產(chǎn)源頭嚴格控制內毒素標準。以藥品生產(chǎn)為例，相關制劑涉及的原料、輔料以及制劑成品中的內毒素限度都有嚴格要求。
生產(chǎn)過程中針對細菌內毒素的有效去除方法也在不斷發(fā)展，包括超濾法、酸堿法、干熱滅菌法、蒸餾法、離子交換法、凝膠過濾法、微波、反滲透和吸附法等等，這些方法在使用時有一定的局限性和優(yōu)缺點，目前醫(yī)藥領域最常使用的還是超濾法、酸堿法和干熱滅菌法。
即使是干熱滅菌也需要在250℃條件下滅菌至少30分鐘才可以去除熱原。由于細菌內毒素疏水性較強，易于在容器、管道、組件和設備表面滋長，干熱滅菌主要用于設備、管道、醫(yī)療器械。使用稀氫氧化鈉溶液煮沸30分鐘以上，也可以對部分工器具、管道進行細菌內毒素去除。
對于注射劑、生物制劑或其他不耐高溫產(chǎn)品，優(yōu)先選用超濾法去除細菌內毒素，超濾膜尺寸一般不超過0.1μm，可以有效去除細菌內毒素，但操作過程注意壓力和溫度控制。
三、現(xiàn)行細菌內毒素檢測方法
產(chǎn)品的細菌內毒素限值一般是通過公式L=K/M計算得到的。其中M為人用每千克體重每小時最大供試品劑量，可參考藥品說明書或具有權威性資料的用法用量。涉及聯(lián)合用藥應考慮其他制劑可能引入的細菌內毒素；兒科用藥、營養(yǎng)不良用藥和惡病質用藥等，應考慮細菌內毒素對體弱患者人群可能導致更嚴重的影響。
注：K 為人每千克體重每小時最大可接受的內毒素劑量，以 EU/ (kg * h)表示；細菌內毒素的單位通常用EU表示，IU是細菌內毒素的國際單位，1EU與1IU相當。
關于細菌內毒素的檢查方法，藥典2020版《1143細菌內毒素檢查法》和《9251細菌內毒素檢查法應用指導原則》中都有詳細的指導，即利用鱟試劑來檢測或量化細菌內毒素，以期通過檢測保證細菌內毒素限度符合藥用質量標準。
由于革蘭氏陰性菌內毒素可以迅速導致鱟血液凝固成凝膠狀，因此采用鱟試劑法檢測內毒素簡便快捷，同時具有較高的靈敏度和特異性，鱟試劑成為理想的內毒素檢測試劑。
《1143細菌內毒素檢查法》主要介紹了凝膠法和光度法：
需要注意的是，如果樣品中含有β-葡聚糖，則要求使用去G因子的鱟試劑進行樣品檢測。這是因為β-葡聚糖會和鱟試劑發(fā)生凝集反應，從而產(chǎn)生假陽性結果。
四、細菌內毒素研究最新進展
4.1細菌內毒素檢測應用于醫(yī)學領域
2023年河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院腫瘤科聯(lián)合臨床營養(yǎng)科對原發(fā)性肝癌放療患者血清中D-乳酸、細菌內毒素、二胺氧化酶含量進行檢測，研究發(fā)現(xiàn)在肝癌患者放療前、放療完成時和放療結束后一個月這三項指標的含量有明顯差異，是評價腸粘膜損傷、腸道營養(yǎng)不良、惡性腫瘤患者術后炎癥及損傷恢復程度的可靠指標。這就是說通過檢測血液中細菌內毒素含量可以評價患者腸粘膜恢復情況，對于腸道營養(yǎng)不良和腸道菌群轉移均有指導意義。
4.2細菌內毒素檢測新技術
電化學分析技術在各行各業(yè)均有應用，電化學分析技術具有靈敏度高，操作簡便的優(yōu)點，已經(jīng)廣泛作為生物原件；核酸適體具有靶向性高、便于修飾的特點。浙江工業(yè)大學藥學院研究者將電化學技術和核酸適體相結合對細菌內毒素進行定量分析，大大彌補現(xiàn)有方法靈敏度低、操作復雜的問題。
除此以外，眾所周知，鱟試劑來源于鱟的血液，鱟大約在地球已經(jīng)生存了4億年，比恐龍出現(xiàn)的還要早，由于醫(yī)藥行業(yè)對鱟血液的大量采集，現(xiàn)在已列為國家二級保護動物，鱟血價格增長迅猛。核酸適體電化學分析技術研究如果能進行更深入的研究，代替鱟血的使用，在后期廣泛用于細菌內毒素的檢測，對于細菌內毒素檢測將是一個很大的進步。那么被譽為“活化石”的鱟也將在地球上有更自由的生長空間。
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