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導(dǎo)讀

黑木耳(Auricularia auricula)是一種著名的傳統(tǒng)食用菌，具有很高的營(yíng)養(yǎng)和藥理價(jià)值，以及代謝和免疫調(diào)節(jié)特性。不可消化發(fā)酵多糖是木耳提取物的主要生物活性成分。然而，木耳多糖(AAP)對(duì)肥胖及相關(guān)代謝終點(diǎn)(包括腸道菌群的作用)影響的確切機(jī)制尚不清楚。本研究通過肥胖性狀分析和代謝組學(xué)分析，評(píng)估AAP對(duì)高脂飲食(HFD)小鼠肥胖的影響。為了確定腸道微生物群在觀察到的抗肥胖作用中的機(jī)制作用，還應(yīng)用了糞便微生物群移植(FMT)和抗生素處理的偽無菌小鼠模型，并結(jié)合16S rRNA基因組衍生的分類分析。結(jié)果表明，暴露于AAP的HFD小鼠抑制了體重增加，減少了脂肪沉積，增強(qiáng)了葡萄糖耐量，同時(shí)上調(diào)了脂肪組織中的產(chǎn)熱蛋白質(zhì)組學(xué)生物標(biāo)志物。血清代謝組學(xué)表明，這些影響與脂肪酸代謝的變化有關(guān)。腸道微生物種群評(píng)估發(fā)現(xiàn)，AAP選擇性地增加了在HFD小鼠中減少的共生細(xì)菌Papillibacter cinnamivorans。值得注意的是，用口服Papillibacter cinnamivorans制劑治療的HFD小鼠減輕了肥胖，這與腸道脂質(zhì)運(yùn)輸和肝臟產(chǎn)熱作用的減少有關(guān)。從機(jī)制上講，P. cinnamivorans通過降低促炎反應(yīng)和腸道通透性，以JAK-STAT信號(hào)相關(guān)的方式調(diào)節(jié)腸道脂質(zhì)代謝和肝臟產(chǎn)熱。

綜上所述，本研究的數(shù)據(jù)表明，AAP通過調(diào)節(jié)腸道脂質(zhì)運(yùn)輸來抑制飲食驅(qū)動(dòng)的肥胖和代謝紊亂，這一機(jī)制依賴于腸道共生的P. cinnamivorans。這些結(jié)果表明，AAP和P. cinnamivorans是新發(fā)現(xiàn)的益生元和益生菌，可以作為新的治療肥胖的藥物。    

論文ID

原名：Auricularia auricula polysaccharides attenuate obesity in mice through gut commensal Papillibacter cinnamivorans

譯名：木耳多糖通過腸道共生Papillibacter cinnamivorans減輕小鼠肥胖

期刊：Journal of Advanced Research

IF：10.7

發(fā)表時(shí)間：2023.8

通訊作者：靳明亮

通訊作者單位：浙江大學(xué)飼料科學(xué)研究所

DOI號(hào)：10.1016/j.jare.2023.08.003

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

結(jié)果

1、AAP減輕了HFD引起的肥胖和代謝紊亂

為了研究AAP對(duì)飲食性肥胖的影響，HFD喂食小鼠8周，并每天口服AAP或生理鹽水(陰性對(duì)照)(圖1A)。8周后，HFD組的體重顯著增加(圖1B)。然而，從第2周開始，AAP顯示出飲食驅(qū)動(dòng)的體重增加減少了38.88%(圖1B-D)。組織學(xué)分析證實(shí)，AAP減少了腹部脂肪沉積和脂肪細(xì)胞大小(圖1E-G)，同時(shí)肝臟和心臟重量降低，但腎臟和脾臟重量沒有差異。進(jìn)一步對(duì)腹部脂肪分析發(fā)現(xiàn)，HFD上調(diào)了脂肪形成基因(Pparγ和Cebpα)和脂肪生成基因(Acc1和Fasn)，而AAP治療下調(diào)了脂肪形成基因(圖1J)。此外，AAP抑制了HFD誘導(dǎo)的肝脂肪變性和血脂異常，肝臟內(nèi)甘油三酯積累減少(圖1H)，血漿甘油三酯(圖1I)、膽固醇(T-CHO，圖1K)和低密度脂蛋白(LDL)水平降低。然而，未觀察到血漿HDL的變化。此外，本研究發(fā)現(xiàn)AAP可以緩解HFD誘導(dǎo)的高血糖，如OGTT期間較低的血糖水平所示(圖1L-M)，表明AAP增強(qiáng)了消耗后葡萄糖的清除。

為了進(jìn)一步闡明AAP對(duì)HFD誘導(dǎo)的肥胖和相關(guān)代謝紊亂的影響，作者進(jìn)行了代謝組學(xué)分析，比較了僅飼喂HFD的小鼠和同時(shí)飼喂AAP的小鼠的血清代謝組學(xué)，并以飼喂LFD的小鼠為對(duì)照。對(duì)197種檢測(cè)到的代謝物進(jìn)行無監(jiān)督PCA分析，發(fā)現(xiàn)HFD、HFD+AAP和LFD喂養(yǎng)小鼠的血清代謝組明顯分離。數(shù)據(jù)表明，AAP治療通過影響血清代謝物譜改善了HFD誘導(dǎo)的代謝紊亂，PLS-DA分析也證明了這一點(diǎn)。對(duì)個(gè)體代謝物的進(jìn)一步分析表明，被HFD升高的11種代謝物被AAP完全逆轉(zhuǎn)到正常水平(圖1N)，其中包括茉莉酸甲酯、皮甾酮、甲基丙二酸、麥角甾醇、四氫皮質(zhì)酮。相關(guān)分析顯示，這些代謝物與肥胖表型(尤其是體重)呈正相關(guān)。代謝途徑分析表明，顯著差異代謝物與脂肪酸代謝相關(guān)的代謝途徑有關(guān)(圖1O)。這些結(jié)果表明，口服AAP可能通過與脂肪酸代謝相關(guān)的方式，預(yù)防了HFD誘導(dǎo)的肥胖及其代謝紊亂。

圖1 口服AAP可避免飲食驅(qū)動(dòng)型肥胖和代謝紊亂。(A)小鼠維持低脂飲食(LFD)或高脂飲食(HFD)，并每天暴露于AAP劑量8周，每個(gè)處理組n=10；(B)體重；(C)體重增加量；(D)體重相對(duì)于LFD的變化；(E)腹部脂肪墊重量；(F)腹部脂肪組織H&E染色圖像；(G)使用Adiposoft從5個(gè)顯微鏡視野對(duì)每只小鼠腹部脂肪組織中的脂肪細(xì)胞大小進(jìn)行測(cè)定；(H)肝臟甘油三酯含量；(I)循環(huán)甘油三酯水平；(J) qPCR分析腹部脂肪中脂肪形成和脂肪生成基因mRNA表達(dá)；(K)循環(huán)T-CHO水平；(L,M) OGTT和相應(yīng)的曲線下面積(AUC)；(N) AAP治療前后HFD小鼠和LFD小鼠血清代謝組顯著差異代謝物的熱圖；(O)代謝物集富集途徑分析。

2、AAP的抗肥胖作用依賴于腸道菌群

為了確定腸道微生物是否在AAP誘導(dǎo)的肥胖和相關(guān)疾病中發(fā)揮作用，用抗生素處理HFD小鼠(圖2A)。如圖2B-C所示，抗生素處理小鼠時(shí)，AAP并沒有減弱HFD引起的體重增加(圖2D)。使用或不使用抗生素處理的小鼠在腹部脂肪重量、脂肪細(xì)胞大小或脂肪形成相關(guān)基因的表達(dá)方面也沒有差異(圖2E-H)。此外，抗生素處理消除了AAP對(duì)HFD誘導(dǎo)的代謝紊亂的影響，包括肝臟甘油三酯水平、外周甘油三酯、TCHO和LDL水平(圖2I-K)，以及葡萄糖清除率(圖2L-M)?？傊珹AP的抗肥胖作用依賴于不同腸道微生物群落的存在。

圖2 腸道微生物群對(duì)AAP對(duì)抗肥胖至關(guān)重要。(A)HFD小鼠在8周內(nèi)暴露于克林霉素、甲硝唑、青霉素、萬古霉素和新霉素(CMPVN)和生理鹽水或AAP的抗生素組合中，每組n=10；(B)體重；(C)體重增加量；(D)肝臟重量；(E)腹部脂肪墊重量；(F)腹部脂肪組織H&E染色圖像；(G)使用Adiposoft從5個(gè)顯微鏡視野對(duì)每只小鼠腹部脂肪組織中的脂肪細(xì)胞大小進(jìn)行測(cè)定；(H) qPCR分析腹部脂肪中脂肪形成和脂肪生成基因mRNA表達(dá)；(I)肝臟甘油三酯含量；(J-K)循環(huán)甘油三酯和T-CHO水平；(L, M) OGTT和相應(yīng)的AUC。

3、FMT證實(shí)了腸道菌群在AAP抗肥胖作用中的作用

為了進(jìn)一步闡明腸道微生物群在AAP誘導(dǎo)效應(yīng)中的作用。對(duì)攝入HFD的常規(guī)小鼠進(jìn)行FMT。將HFD小鼠的糞便菌群移植到受體HFD小鼠中(圖3A)，這些供體小鼠分別接受了不含抗生素的AAP、含抗生素的AAP或生理鹽水(對(duì)照)處理。與對(duì)照組小鼠相比，AAP處理小鼠的FMT顯著降低了體重增加和器官重量(圖3B-C)。然而，AAP+抗生素處理小鼠的FMT受體與HFD小鼠沒有區(qū)別(圖3B-C)。同樣，與HFD-FMT受體相比，AAP-FMT受體小鼠的肝臟和外周循環(huán)甘油三酯積累水平(圖3D-E)以及血清T-CHO、HDL和LDL水平均顯著降低，這表明經(jīng)AAP處理的糞便菌群移植也降低了脂質(zhì)代謝。為了進(jìn)一步驗(yàn)證，我們分析了腹部脂肪沉積和脂肪形成相關(guān)基因的表達(dá)水平。雖然在對(duì)照組接受FMT的小鼠與抗生素處理的AAP小鼠之間沒有發(fā)現(xiàn)差異，但在接受AAP-FMT的小鼠中檢測(cè)到顯著減少(圖3F-I)。關(guān)于OGTT，AAP-FMT受體的血糖水平升高也明顯降低，抗生素處理消除了AAP-FMT的作用(圖J-K)。總體而言，這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了微生物群在AAP抗肥胖作用中的作用。

圖3 來自AAP暴露小鼠的FMT減輕了HFD小鼠的肥胖和代謝紊亂。(A)將給予生理鹽水或AAP(含/不含抗生素)的HFD小鼠糞便微生物群移植到HFD受體小鼠中，每組n=10；(B)體重；(C)體重增加量；(D)肝臟甘油三酯含量；(E)循環(huán)甘油三酯水平；(F)腹部脂肪組織H&E染色圖像；(G)腹部脂肪墊重量；(H)使用Adiposoft從5個(gè)顯微鏡視野對(duì)每只小鼠腹部脂肪組織中的脂肪細(xì)胞大小進(jìn)行測(cè)定；(I) qPCR分析腹部脂肪中脂肪形成和脂肪生成基因mRNA表達(dá)；(J, K) OGTT和相應(yīng)的AUC。

4、AAP治療改變了HFD誘導(dǎo)的肥胖小鼠的腸道菌群

為了進(jìn)一步了解腸道微生物群在AAP減輕肥胖中的作用，本研究通過16S rRNA測(cè)序研究了腸道微生物群的組成。雖然組間α-多樣性無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但組間β-多樣性，如PCoA所示，顯示出四個(gè)獨(dú)立的聚類，表明腸道微生物群組成對(duì)HFD、AAP和抗生素干預(yù)的反應(yīng)存在差異(圖4A-B)。

采用LEfSe分析方法鑒定AAP在HFD小鼠中改變的細(xì)菌類群。在屬水平上，與LFD相比，HFD改變了8個(gè)屬(5個(gè)屬增加，3個(gè)屬減少)，包括Lachnoclostridium、Enterorhabdus、Negativibacillus、Aeromonas、Hypnocyclicus、Candidatus Bacilloplasma、Papillibacter和Bifidobacterium(圖4C)。與HFD小鼠相比，AAP治療顯著降低了Mucispirillum的水平，增加了Peptococcus、Muribaculum、Anaerovorax和Papillibacter的水平，這些細(xì)菌被抗生素消除(圖4C)。值得注意的是，只有Papillibacter屬的水平被HFD抑制，隨后被AAP恢復(fù)(圖4C)。在GenBank序列數(shù)據(jù)庫中檢索AAP與其他HFD組之間存在顯著差異的OTU。在整體上，HFD顯著改變了71個(gè)OTUs，而與HFD相比，AAP改變了83個(gè)細(xì)菌OTUs(圖4C)。本研究進(jìn)一步評(píng)估了正常飲食組與HFD組、HFD組與HFD+AAP組、HFD+AAP組與HFD+AB+AAP組之間共有OTU的比較。共得到16個(gè)OUTs，包括P. cinnamivorans、Parabacteroides goldsteinii、Alistipes putredinis、Clostridium saccharolyticum、Caprobacter fermentans、Clostridium thermocellum、Massilimaliae timonensis、Clostridium fessum、Acetatifactor muris、Paramuribaculum intestinale、Aminipila butyrica、Clostridium indolis、Clostridium celerecrescens、Muribaculum intestinale、Kineothrix alysoides和Faecalicatena orotica(圖4C)。因此，本研究的重點(diǎn)是肥胖與通過AAP調(diào)節(jié)的腸道細(xì)菌種類水平相關(guān)的可能性。相關(guān)分析表明，細(xì)菌水平，包括OTU17 (P. goldsteinii)、OTU22 (A. putredinis)和OTU56(P. cinnamivorans)，與肥胖呈顯著負(fù)相關(guān)(圖4D)。這些結(jié)果表明，AAP以一種腸道微生物群特異性的方式調(diào)節(jié)了HFD誘導(dǎo)的肥胖。

圖4 AAP對(duì)肥胖小鼠腸道菌群的影響。(A) Chao1指數(shù)評(píng)估的α-多樣性；(B)基于Bray-Curtis距離的PCoA β多樣性分析；(C)利用LEfSe分析從糞便微生物群中鑒定出差異豐富的屬和操作分類單元(OTUs)；(D)所有16種已知細(xì)菌物種與肥胖相關(guān)終點(diǎn)的相關(guān)分析。

5、P. cinnamivorans是AAP降低HFD誘導(dǎo)的肥胖的關(guān)鍵因子

由于AAP的抗肥胖作用可通過FMT轉(zhuǎn)移，因此作者評(píng)估了供體糞便微生物群移植對(duì)微生物多樣性的影響，并對(duì)供體糞便樣本進(jìn)行了16S rRNA基因測(cè)序。結(jié)果包括了來自混合篩選的一系列微生物群變化的影響(圖5A)。為了解釋處理對(duì)β多樣性的影響，本研究發(fā)現(xiàn)HFD、AAP和抗生素組之間存在顯著差異，這表明FMT重現(xiàn)了AAP對(duì)HFD誘導(dǎo)的肥胖小鼠腸道微生物群的影響(圖5B)。共鑒定出54個(gè)差異顯著的細(xì)菌屬，其中3組共有14個(gè)細(xì)菌屬。在這些屬中，與AAP-FMT受體相比，9個(gè)屬被抗生素處理的糞便菌群顯著改變，包括Aerosphaera、Gemella、Coriobacteriaceae、Facklamia、Corynebacterium、Kurthia、Aerococcus、Ruminococcaceae、Glutamicibacter，在移植HFD小鼠糞便微生物群的小鼠中7個(gè)屬發(fā)生了改變，包括Psychrobacter、Ruminococcaceae、Glutamicibacter、Eubacterium nodatum group、Fusobacterium、Faecalibacterium和Prevotella(圖5C)。此外，利用GenBank序列數(shù)據(jù)庫分析三組間的差異OTU。與HFD-FMT處理的小鼠相比，AAP-FMT處理的小鼠中有26個(gè)OTUs被鑒定為轉(zhuǎn)移物種，抗生素-FMT處理的小鼠中有24個(gè)OTUs與AAP-FMT處理的小鼠相比發(fā)生了變化(圖5C)。本研究重點(diǎn)關(guān)注了兩個(gè)群落的6個(gè)重疊OTU，發(fā)現(xiàn)與HFD-FMT組相比，除了OTU277_Roseburia intestinalis (圖5C)外，其余5個(gè)重疊OTU在AAP-FMT組中增加，但在抗生素-FMT組中沒有增加。接受AAP和AAP-FMT治療的小鼠均出現(xiàn)了肥胖減輕現(xiàn)象，因此，兩組的糞便樣本中都存在抗肥胖的功能性腸道共生細(xì)菌。值得注意的是，從這兩種測(cè)序分析的比較中只鑒定到OTU5_P. cinnamivorans(圖5D)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，P. cinnamivorans的相對(duì)豐度與肥胖趨勢(shì)呈負(fù)相關(guān)(圖5E)。這些數(shù)據(jù)表明，P. cinnamivorans可能是AAP降低HFD誘導(dǎo)的肥胖的關(guān)鍵因素。

圖5 P. cinnamivorans被認(rèn)為是AAP降低飲食性肥胖的關(guān)鍵細(xì)菌。(A)利用Chao1指數(shù)評(píng)估α-多樣性；(B)基于Bray-Curtis距離的PCoA β多樣性分析；(C)利用LEfSe分析從糞便微生物群中鑒定出差異豐富的屬和操作分類單元(OTUs)；(D)關(guān)鍵細(xì)菌鑒定的分析策略；(E) P. cinnamivorans與肥胖趨勢(shì)的相關(guān)分析。 

6、P. cinnamivorans處理保護(hù)小鼠免受HFD誘導(dǎo)的肥胖和代謝紊亂

為了證實(shí)P. cinnamivorans在HFD小鼠中促進(jìn)抗肥胖作用，HFD小鼠每天給藥商業(yè)P. cinnamivorans菌株或生理鹽水(對(duì)照組)，持續(xù)8周(圖6A)。經(jīng)4周處理后，糞便樣品中P. cinnamivorans的相對(duì)豐度顯著增加。此外，相對(duì)于HFD小鼠，體重增加有所減弱，并且這些影響在研究的最后4周持續(xù)存在(圖6B-D)。P. cinnamivorans處理也被證明可以有效減少HFD誘導(dǎo)的肥胖性狀，如肝臟和腹部脂肪重量(圖6E-F)，這些結(jié)果伴隨著腹部脂肪組織中脂肪細(xì)胞的平均大小和脂肪細(xì)胞的平均面積的變化(圖6G-H)。然后，我們比較了對(duì)照組和P. cinnamivorans處理的小鼠腹部脂肪中脂肪代謝相關(guān)基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)P. cinnamivorans也顯著降低了Cebpα和Pparγ的表達(dá)(圖6I)。此外，為了進(jìn)一步表征代謝表型，進(jìn)行了OGTT。結(jié)果顯示，與HFD小鼠相比，P. cinnamivorans處理小鼠在葡萄糖注射后60、90和120分鐘的血糖濃度降低(圖6J-K)。這些數(shù)據(jù)表明，P. cinnamivorans治療可以保護(hù)小鼠免受HFD誘導(dǎo)的肥胖和代謝紊亂。

圖6 P. cinnamivorans治療保護(hù)小鼠免受飲食驅(qū)動(dòng)型肥胖和代謝紊亂。(A)低脂飼料飼喂小鼠和高脂飼料飼喂小鼠，每天灌胃生理鹽水或P. cinnamivorans (PC)，持續(xù)8周；(B)體型和脂肪墊的代表性圖片；(C)體重；(D)體重增加量；(E)肝臟重量；(E)腹部脂肪墊重量；(F)腹部脂肪組織H&E染色圖像；(G)從5個(gè)顯微鏡視野對(duì)每只小鼠腹部脂肪組織中的脂肪細(xì)胞大小和數(shù)量進(jìn)行測(cè)定；(I) qPCR分析腹部脂肪中Cebp和Pparγ mRNA表達(dá)；(J, K) OGTT和相應(yīng)的AUC。

7、P. cinnamivorans能減輕HFD誘導(dǎo)的肥胖小鼠的炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)腸道屏障功能

在確定了P. cinnamivorans減少肥胖表型之后，下一步探索這些效應(yīng)的機(jī)制。為此，作者進(jìn)行了RNA測(cè)序(RNA-seq)分析，以更全面地分析LFD小鼠、飼喂HFD小鼠和HFD-P. cinnamivorans處理小鼠結(jié)腸組織的基因表達(dá)譜(圖7A)。差異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，與LFD小鼠相比，HFD小鼠有1479個(gè)差異表達(dá)基因(DEG)，其中818個(gè)基因上調(diào)，661個(gè)基因下調(diào)。同時(shí)，與HFD組相比，在P. cinnamivorans處理獲得的2571個(gè)基因中，1335個(gè)基因上調(diào)，1236個(gè)基因下調(diào)(圖7B)。KEGG富集分析表明，炎癥相關(guān)通路位于HFD_up vs LFD和PC_down vs HFD兩個(gè)簇的重疊處，包括JAK-STAT信號(hào)通路、抗原加工和遞呈、炎癥性腸病和趨化因子信號(hào)通路(圖7C-D)。因此，為了進(jìn)一步研究P. cinnamivorans在HFD介導(dǎo)的腸道炎癥中的作用，我們檢測(cè)了腸道炎癥反應(yīng)。H&E染色形態(tài)學(xué)分析顯示，HFD引起了相當(dāng)大的組織損傷，如上皮層潰瘍，水腫，腸壁隱窩損傷，粒細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤(rùn)粘膜(圖7E-F)。相比之下，P. cinnamivorans處理減少了HFD誘導(dǎo)的結(jié)腸炎癥的組織學(xué)變化(圖7E-F)。 為了探究P. cinnamivorans對(duì)HFD誘導(dǎo)的炎癥的作用，作者量化了炎癥標(biāo)志物的表達(dá)。如圖7G所示，P. cinnamivorans處理顯著降低了促炎細(xì)胞因子如Tnfα、Il6和Il18的表達(dá)。為了驗(yàn)證這些結(jié)果，分析了結(jié)腸和血清中TNF-α和IL-6的分泌情況，結(jié)果與基因表達(dá)結(jié)果一致(圖7H-I)。此外，為了進(jìn)一步了解P. cinnamivorans抗炎作用的分子機(jī)制，我們對(duì)JAK-STAT信號(hào)通路進(jìn)行了基因集富集分析(GSEA)(圖7J)。數(shù)據(jù)顯示，通過分析Jak1、Jak3、Akt3、Stat1和Stat4的轉(zhuǎn)錄水平，P. cinnamivorans處理顯著抑制HFD小鼠JAK-STAT信號(hào)的激活(圖7K)。這表明，P. cinnamivorans處理通過JAK-STAT信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)途徑抑制了HFD誘導(dǎo)的腸道炎癥反應(yīng)。

先前的一項(xiàng)研究表明，炎癥的衰減與腸道通透性有關(guān)，而腸道通透性依賴于緊密連接。利用免疫熒光染色和透射電鏡探究P. cinnamivorans對(duì)腸道通透性的影響，透射電鏡觀察顯示，HFD小鼠腸道組織緊密連接不明顯，密度降低，細(xì)胞間隙變寬，而P. cinnamivorans處理可保護(hù)腸道免受HFD引起的損傷(圖7L)。細(xì)胞層緊密連接標(biāo)記物Claudin-1、Occludin和ZO-1的免疫熒光染色表明存在緊密連接復(fù)合物。值得注意的是，作者發(fā)現(xiàn)P. cinnamivorans處理有效地恢復(fù)了ZO-1的表達(dá)，但沒有恢復(fù)Claudin-1和Occludin的表達(dá)(圖7M)。同樣，ZO-1的蛋白和基因表達(dá)水平也支持了P. cinnamivorans對(duì)HFD損傷的腸屏障功能的保護(hù)作用(圖7N-O)。此外，與HFD小鼠相比，P. cinnamivorans處理小鼠的血清內(nèi)毒素或LPS水平也顯著降低，這表明P. cinnamivorans處理降低了HFD小鼠的腸道通透性(圖7P)。綜上所述，P. cinnamivorans對(duì)肥胖動(dòng)物的抗肥胖和抗炎作用與增強(qiáng)腸道屏障功能有關(guān)。

圖7 P. cinnamivorans減輕HFD誘導(dǎo)的肥胖小鼠的炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)腸道屏障功能。(A)通過RNA-seq鑒定的結(jié)腸差異表達(dá)基因(DEGs)熱圖；(B)火山圖顯示HFD+PC vs. HFD的DEGs；(C)對(duì)HFD vs. LFD的DEGs基因進(jìn)行KEGG分析；(D) HFD+PC vs. LFD的DEG下調(diào)基因的KEGG分析；(E-F)結(jié)腸組織連續(xù)切片用H&E進(jìn)行染色和組織學(xué)評(píng)分；(G) qPCR分析結(jié)腸炎癥標(biāo)志物表達(dá)；(H-I) ELISA法測(cè)定結(jié)腸組織(H)和血清(I)中TNF-α和IL-6的分泌情況。(J) GSEA中JAK/STAT信號(hào)通路富集圖。(K) JAK-STAT信號(hào)基因的RNA-seq表達(dá)數(shù)據(jù)；(L)透射電鏡觀察腸道緊密連接的形態(tài)學(xué)變化；(M) ZO-1(綠色)和DAPI(藍(lán)色)的免疫熒光分析；(N) Western blot檢測(cè)ZO-1的表達(dá)；(O) qPCR分析結(jié)腸ZO-1表達(dá)；(P)血清內(nèi)毒素(脂多糖，LPS)水平。

8、P. cinnamivorans通過調(diào)節(jié)腸道脂質(zhì)吸收和肝臟產(chǎn)熱來減輕HFD誘導(dǎo)的肥胖

與HFD小鼠相比，HFD和P. cinnamivorans處理后的低表達(dá)基因在脂質(zhì)代謝相關(guān)途徑中也顯著富集，如脂肪酸代謝、不飽和脂肪酸的生物合成、脂肪酸延伸和亞油酸代謝(圖8A)。這些結(jié)果促使我們研究P. cinnamivorans是否通過調(diào)節(jié)腸道脂質(zhì)吸收來介導(dǎo)HFD喂養(yǎng)小鼠的抗炎和抗肥胖作用。通過qPCR分析，我們證實(shí)了P. cinnamivorans處理小鼠結(jié)腸和空腸關(guān)鍵脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白mRNA編碼的減少，包括Mtp、Abca1、Fatp4和Npc1(圖8B)。這一變化與血清甘油三酯、膽固醇和游離脂肪酸水平的顯著降低有關(guān)(圖8C-E)。與飼喂HFD的小鼠相比，AAP處理小鼠和AAP-FMT小鼠中這些脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)下調(diào)也證實(shí)了這一觀點(diǎn)。

隨后，本研究將肝臟轉(zhuǎn)錄組分為三組(圖8F)。從KEGG注釋的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，在PC_up和HFD中存在一定的與肥胖相關(guān)的KEGG通路，尤其是產(chǎn)熱途徑(圖8G)。關(guān)于產(chǎn)熱途徑相關(guān)基因表達(dá)的數(shù)據(jù)顯示，與生理鹽水對(duì)照組相比，P. cinnamivorans處理小鼠肝臟中與產(chǎn)熱信號(hào)相關(guān)的基因上調(diào)(圖8H)。為了進(jìn)一步研究P. cinnamivorans對(duì)肝臟產(chǎn)熱的影響，分別用H&E和TEM對(duì)肝臟切片進(jìn)行了染色。結(jié)果顯示，P cinnamivorans出來促進(jìn)肝臟脂肪變性，以減輕HFD誘導(dǎo)的脂肪沉積(圖8I)。在P. cinnamivorans處理的小鼠中，低水平的甘油三酯進(jìn)一步支持了這一發(fā)現(xiàn)(圖8J)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)了P . cinnamivorans通過調(diào)節(jié)腸道脂質(zhì)吸收和肝臟產(chǎn)熱實(shí)現(xiàn)AAP的抗肥胖作用。

圖8 P. cinnamivorans通過調(diào)節(jié)腸道脂質(zhì)吸收和肝臟產(chǎn)熱來減輕HFD誘導(dǎo)的肥胖。(A) GSEA脂肪酸代謝途徑富集圖；(B) qPCR分析結(jié)腸中脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)；(C-E)血清中甘油三酯(C)、膽固醇(D)和非酯化游離脂肪酸(NEFA，E)水平；(F) RNA-seq鑒定的肝臟差異表達(dá)基因(DEGs)熱圖；(G) HFD+PC vs. HFD的DEG上調(diào)基因的KEGG分析；(H) RNA-seq數(shù)據(jù)集中選定的產(chǎn)熱調(diào)節(jié)基因相對(duì)表達(dá)的熱圖；(I)采用H&E染色和透射電鏡(TEM)評(píng)估肝臟脂肪變性；(J)肝臟甘油三酯水平。    

討論

腸道微生物群與代謝綜合征的許多方面密切相關(guān)，使其成為治療肥胖和相關(guān)合并癥的潛在靶點(diǎn)。飲食，特別是飲食中的碳水化合物是腸道微生物組成和活性的關(guān)鍵決定因素。Akkermansia muciniphila、Faecalibacterium prausnitzii和Propionibacterium freudenreichii等細(xì)菌物種以及阿拉伯木聚糖、抗性淀粉、靈芝多糖和中國(guó)被毛孢多糖等不可消化的碳水化合物已經(jīng)顯示出作為下一代益生菌和益生元治療肥胖及其失調(diào)免疫代謝的前景。本研究證明了HFD喂養(yǎng)的小鼠每日給藥AAP可以減輕飲食驅(qū)動(dòng)型肥胖和相關(guān)代謝紊亂(圖9)。本研究確定了AAP抗肥胖作用的幾個(gè)基本機(jī)制，包括AAP誘導(dǎo)的腸道微生物群落變化在觀察到的健康益處中的作用。值得注意的是，腸道共生的P. cinnamivorans被確定為AAP治療逆轉(zhuǎn)HFD誘導(dǎo)的肥胖和代謝紊亂的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。對(duì)可能機(jī)制的進(jìn)一步評(píng)估表明，P. cinnamivorans的富集以JAK-STAT信號(hào)相關(guān)的方式降低炎癥反應(yīng)和腸道通透性，從而調(diào)節(jié)腸道脂質(zhì)代謝和肝臟產(chǎn)熱。因此，本研究的結(jié)果支持使用P. cinnamivorans作為益生菌補(bǔ)充劑來改善肥胖相關(guān)代謝異常的潛力。

圖9 研究模型的示意圖。AAP選擇性增強(qiáng)了P. cinnamivorans(一種共生細(xì)菌)，以減輕肥胖及相關(guān)的代謝失調(diào)。從機(jī)制上講，P. cinnamivorans通過降低促炎反應(yīng)和腸道通透性，以JAK-STAT信號(hào)相關(guān)的方式調(diào)節(jié)腸道脂質(zhì)代謝和肝臟產(chǎn)熱。

雖然先前的研究表明木耳多糖具有抗氧化活性，調(diào)節(jié)腸道微生物群，降低血糖水平，但這種多糖調(diào)節(jié)腸道微生物群和降低體內(nèi)體重的可能性從未被研究過。因此，本研究建立飲食性肥胖模型，評(píng)估AAP的抗肥胖作用，并研究腸道菌群在這一過程中的作用。結(jié)果觀察到AAP可以有效地減少體重增加、脂肪沉積和葡萄糖耐量。據(jù)報(bào)道，多糖作為一種膳食纖維在動(dòng)物后腸中降解，并影響腸道微生物群的豐度和多樣性。有趣的是，最近的一項(xiàng)研究表明，將肥胖個(gè)體的腸道微生物群移植到喂食HFD的小鼠中，相比于從瘦弱個(gè)體移植糞便，體重增加更大，肥胖相關(guān)代謝紊亂的水平更高。本研究的偽無菌小鼠模型，應(yīng)用聯(lián)合抗生素處理來清除腸道微生物，證明AAP在清除腸道微生物群后失去有益作用，支持AAP可能保持腸道微生物群穩(wěn)態(tài)的可能性。AAP的抗肥胖作用可通過糞便移植轉(zhuǎn)移，這也支持了肥胖與腸道微生物群改變有關(guān)的概念。然而，要驗(yàn)證腸道微生物群的作用，還需要生物模型。本研究的結(jié)果表明，腸道微生物群可以通過飲食干預(yù)或糞菌移植來調(diào)節(jié)，AAP可以作為一種益生元來誘導(dǎo)特定的腸道微生物群變化，從而減少肥胖個(gè)體的體重增加、炎癥和代謝紊亂。 為了進(jìn)一步探索腸道微生物群在AAP減輕肥胖中的機(jī)制作用，作者測(cè)量了服用AAP治療的肥胖小鼠的微生物群組成。結(jié)果觀察到，在HFD喂養(yǎng)的小鼠中補(bǔ)充AAP可以恢復(fù)LFD喂養(yǎng)小鼠中觀察到的腸道微生物群，包括益生菌P. goldsteinii，該益生菌先前被報(bào)道可以減少肥胖。然而，其他一些與肥胖負(fù)相關(guān)的細(xì)菌，如Akkermansia muciniphila和Barnesiella spp.在本研究中未被檢測(cè)到。這一觀察結(jié)果表明，AAP可能通過改變其他特定細(xì)菌物種的水平來產(chǎn)生抗肥胖作用，如P. cinnamivorans、Muribaculum和Anaerovorax。因此，作者比較了供體和受體的糞便微生物群組成，并確定了P. cinnamivorans是AAP減少飲食誘導(dǎo)肥胖的關(guān)鍵因素，這在使用P. cinnamivorans商業(yè)菌株的HFD誘導(dǎo)肥胖模型中得到了進(jìn)一步證實(shí)。肥胖性狀和代謝紊亂表型表明，AAP的抗肥胖作用主要由P. cinnamivorans產(chǎn)生，這是一種嚴(yán)格厭氧、革蘭氏陽性、不產(chǎn)孢細(xì)菌，廣泛存在于動(dòng)物腸道中。P. cinnamivorans是Papillibacter屬的一種，另一種是未分類的Papillibacter。此外，最近的一項(xiàng)研究表明，它在地中海飲食的人群中升高，這表明P. cinnamivorans對(duì)人類有益。Rensen等人通過系統(tǒng)發(fā)育分析了28名受試者(BMI 18.6-60.3 kg/m2)的糞便微生物群結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)P. cinnamivorans與肥胖患者的局部和全身炎癥密切相關(guān)。同樣，一項(xiàng)針對(duì)個(gè)體、群體特異性腸道微生物群的研究表明，在超重男性中，P. cinnamivorans與組織特異性胰島素敏感性之間存在聯(lián)系?？偟膩碚f，這些結(jié)果表明，腸道共生P. cinnamivorans是一種新型益生菌，有可能被用作減輕肥胖及其相關(guān)合并癥的治療靶點(diǎn)。然而，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，益生菌對(duì)宿主健康終點(diǎn)的影響存在很大程度的差異，這取決于所施用的物種/菌株。

本文研究了P. cinnamivorans (ATCC 700879)的作用，為今后對(duì)該屬內(nèi)其他菌株的鑒定提供了有用的數(shù)據(jù)。其他已知的與Papillibacter密切相關(guān)的菌株，如Faecabilacium和Subdoligranulum屬，其潛在的抗肥胖作用也需要進(jìn)一步關(guān)注和探索。 至于P. cinnamivorans減少飲食引起的肥胖的分子機(jī)制，本研究的RNA-seq結(jié)果已經(jīng)證明了在減少炎癥方面的關(guān)鍵作用。結(jié)腸和血清中細(xì)胞因子水平的降低也證實(shí)了這一觀點(diǎn)。目前HFD誘導(dǎo)的慢性炎癥和肥胖相關(guān)疾病的模型主要是由腸道微生物群的生態(tài)失調(diào)和體循環(huán)中LPS水平的升高來解釋的。先前的研究表明，過量的脂肪攝入會(huì)增加腸道通透性，使脂多糖進(jìn)入腸肝循環(huán)。因此，長(zhǎng)期升高的循環(huán)腸道源性LPS或“代謝性內(nèi)毒素血癥”可通過激活TLR4信號(hào)導(dǎo)致持續(xù)的全身性炎癥。此外，先前的一項(xiàng)研究表明，肥胖動(dòng)物體內(nèi)促炎細(xì)胞因子(如TNF-α、IL-6和IL-18)的過量產(chǎn)生可能是導(dǎo)致慢性炎癥和代謝紊亂的原因。同樣，一項(xiàng)對(duì)靈芝菌絲水提物的研究發(fā)現(xiàn)，它可以增強(qiáng)AKT的磷酸化，降低肝臟中促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，從而改善胰島素敏感性。本研究的結(jié)果表明，添加P. cinnamivorans可以改善HFD喂養(yǎng)的肥胖小鼠的腸道屏障完整性，減少代謝性內(nèi)毒素血癥，并減輕結(jié)腸和血清中細(xì)胞因子的產(chǎn)生。此外，我們確定JAK-STAT信號(hào)是負(fù)責(zé)這些作用的主要分子機(jī)制。盡管如此，我們不能排除P. cinnamivorans也可能直接影響TLR2等促炎信號(hào)通路的可能性，TLR2已被報(bào)道控制肥胖和胰島素抵抗。 在肥胖背景下，炎癥的傳統(tǒng)認(rèn)知主要集中在炎癥介質(zhì)對(duì)與肥胖相關(guān)的繼發(fā)性代謝紊亂發(fā)病機(jī)制的有害影響。本研究的實(shí)驗(yàn)表明，在HFD喂養(yǎng)的小鼠中，P. cinnamivorans降低了參與腸道脂肪酸吸收的基因的表達(dá)，并增強(qiáng)了肝臟產(chǎn)熱。控制產(chǎn)熱可以增加能量消耗并改善新陳代謝。這些結(jié)果表明，P. cinnamivorans可以通過降低脂質(zhì)吸收和促進(jìn)肝臟產(chǎn)熱兩種途徑的結(jié)合來減輕肥胖。

這一結(jié)論與先前的一項(xiàng)研究一致，該研究表明，肝臟產(chǎn)熱升高可以改善代謝健康并減輕體重增加。

 綜上所述，這項(xiàng)體內(nèi)小鼠研究的結(jié)果表明，AAP通過以腸道微生物依賴的方式調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、腸道通透性和脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)/代謝，減輕了肥胖和相關(guān)的代謝失調(diào)。這些發(fā)現(xiàn)為AAP作為益生元的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)，同時(shí)也證明了進(jìn)一步評(píng)估腸道共生P. cinnamivorans作為治療和預(yù)防肥胖及其代謝合并癥的潛在下一代益生菌的必要性。 

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